邱夢(mèng)君，熊枝繁，何曉曉，畢檸瑞，汪朦朦，楊盛力

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

生物鐘是生物在漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中形成的穩(wěn)定內(nèi)在生物節(jié)律，在分子水平上由許多生物鐘基因調(diào)控，如Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC1和DEC2[1]。生物鐘基因在分子水平上協(xié)調(diào)表達(dá)，通過(guò)機(jī)體新陳代謝來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞和器官的生長(zhǎng)、衰老[2]。腫瘤的發(fā)生是由于機(jī)體在基因水平上失去了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)正常的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖紊亂。生物鐘基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮直接或間接作用[3]。2018年1～6月，本研究采用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析生物鐘基因在腹部惡性腫瘤組織與鄰近正常組織中的表達(dá)差異，初步探討生物鐘基因在腹部惡性腫瘤中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料 從TCGA網(wǎng)站(https://cancergenome.nih.gov/)下載最新14個(gè)生物鐘基因(Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC1、DEC2和RORA)在6種腹部惡性腫瘤(胃癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌和腎癌)組織中的RNA-Seq數(shù)據(jù)，包括371例份肝癌與50例份鄰近正常組織，538例份腎癌與72例份鄰近正常組織，478例份結(jié)腸癌與41例份鄰近正常組織，166例份直腸癌與10例份鄰近正常組織，375例份胃癌與32例份鄰近正常組織，177例份胰腺癌與4例份鄰近正常組織。

1.2 研究方法 用Bioconductor (http://www.bioconductor.org/)的edgeR去標(biāo)準(zhǔn)化RNA-Seq數(shù)據(jù)。惡性腫瘤組織和鄰近正常組織均以標(biāo)準(zhǔn)化RNA-Seq數(shù)據(jù)表達(dá)量的平均值為基礎(chǔ)，比平均值高的為高表達(dá)，比平均值低的為低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。生物鐘基因在惡性腫瘤組織與鄰近正常組織中的差異表達(dá)比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在不同的腹部惡性腫瘤組織中，生物鐘基因表達(dá)不一。14個(gè)生物鐘基因在肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌組織中均低表達(dá)，其中Cry2、CLOCK、Timeless、NPAS2、NR1D1、DEC1、DEC2、RORA在肝癌組織中的表達(dá)低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per2、Cry1、Cry2、CLOCK、Timeless、NPAS2、NR1D1、NR1D2、DEC2、RORA在腎癌組織中的表達(dá)低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Timeless、BMAL1、NR1D2、DEC1、DEC2、RORA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per3、Cry1、Cry2、CLOCK、BMAL1、NPAS2、NR1D1、DEC2、RORA在直腸癌組織中的表達(dá)低于其鄰近正常組織(P均<0.05)，Per1、Per3、Cry2、CLOCK、Timeless、BMAL1、NPAS2在胃癌組織中的表達(dá)低于其鄰近正常組織(P均<0.05)。14個(gè)生物鐘基因在胰腺癌組織的表達(dá)與其鄰近正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

生物鐘是通過(guò)參與生理、生化、行為過(guò)程而獲得的、調(diào)控機(jī)體晝夜周期的內(nèi)在系統(tǒng)[4]，包括中樞生物鐘和外周生物鐘。中樞生物鐘是節(jié)律的起點(diǎn)，可自主產(chǎn)生并維持日周期節(jié)律，由此發(fā)出的信息控制機(jī)體的生理節(jié)律，包括睡眠覺(jué)醒、血壓、心率、呼吸、體溫、臟器活動(dòng)、激素和神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)、細(xì)胞分裂等。外周生物鐘受中樞生物鐘直接或間接控制，但在失去中樞生物鐘的控制后，外周生物鐘亦可以獨(dú)立啟動(dòng)，表現(xiàn)為細(xì)胞代謝和增殖的晝夜節(jié)律[5，6]。生物鐘基因通過(guò)調(diào)節(jié)許多下游基因來(lái)影響細(xì)胞的生命。在哺乳動(dòng)物的基因組中，生物鐘基因調(diào)控2%～10%基因的表達(dá)，這些基因被稱(chēng)為時(shí)鐘控制基因[7，8]。生物鐘基因的異常表達(dá)可通過(guò)對(duì)下游時(shí)鐘控制基因的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤、內(nèi)分泌疾病、心血管疾病等疾病的發(fā)生[9，10]。

細(xì)胞周期基因亦可呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，各種不同的細(xì)胞周期蛋白控制著細(xì)胞周期的各個(gè)階段。生物鐘基因的表達(dá)和特定的細(xì)胞周期階段具有相關(guān)性[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，14個(gè)生物鐘基因在6種腹部惡性腫瘤癌組織中均低表達(dá)，表明生物鐘基因表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期基因下調(diào)，干擾細(xì)胞周期的不同階段，可造成惡性腫瘤細(xì)胞周期改變，使細(xì)胞呈現(xiàn)不受控制的異常增殖狀態(tài)。此外，生物鐘基因在惡性腫瘤組織中的表達(dá)異?？赏ㄟ^(guò)調(diào)控癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等時(shí)鐘控制基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤新生血管形成等生物學(xué)過(guò)程[4]。據(jù)報(bào)道，Per2基因低表達(dá)會(huì)引起p53、Bax和Timp-2基因表達(dá)下調(diào)，Ki-67、Mdm2、c-Myc和Bcl-2基因表達(dá)上調(diào)[7，13]。有研究還發(fā)現(xiàn)，Per2亦能抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄[13]，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。炎癥因子是腫瘤形成的重要介質(zhì)，而人體的免疫系統(tǒng)可以清除炎癥因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的屏障作用。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子和血液中的B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫均具有明顯的節(jié)律性。因此，當(dāng)生物鐘基因紊亂導(dǎo)致晝夜節(jié)律失衡后，炎癥反應(yīng)暴發(fā)，免疫系統(tǒng)失去穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制和病情惡化[14，15]。

表1 14個(gè)生物鐘基因在腹部惡性腫瘤組織及鄰近正常組織中的表達(dá)比較(例份)

細(xì)胞內(nèi)的生物節(jié)律是生物鐘基因通過(guò)兩個(gè)重要的反饋回路實(shí)現(xiàn)的[16]。生物鐘基因存在兩個(gè)重要的反饋回路。①CLOCK與BMAL1形成CLOCK/BMAL1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，隨后通過(guò)與Per1～3和Cry1、2基因啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄。編碼的Per1～3和Cry1、2蛋白會(huì)形成一個(gè)多聚體，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與CLOCK/BMAL1直接結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而阻遏Per1～3和Cry1、2的轉(zhuǎn)錄，Per1～3和Cry1、2蛋白的降解會(huì)重新啟動(dòng)CLOCK/BMAL1的轉(zhuǎn)錄，開(kāi)始一個(gè)新的晝夜節(jié)律周期。②CLOCK與BMAL1形成的異二聚體激活孤兒核受體Rev-Erb基因的轉(zhuǎn)錄。Rev-Erb基因編碼蛋白可再與BMAL1啟動(dòng)子相結(jié)合并阻遏其轉(zhuǎn)錄。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，轉(zhuǎn)錄后基因的修飾也參與了晝夜節(jié)律蛋白的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因的表達(dá)在鄰近正常組織中趨勢(shì)不一，一方面可能是因?yàn)橄掠紊镧娀虮磉_(dá)水平的差異，通過(guò)反饋回路反應(yīng)性地增加或降低上游生物鐘的表達(dá)水平；另一方面可能是因?yàn)楸狙芯苦徑＝M織樣本量太少，存在誤差。

綜上所述，生物鐘基因異常表達(dá)在腹部惡性腫瘤組織中普遍存在。然而，導(dǎo)致這些惡性腫瘤組織生物鐘基因表達(dá)差異的具體機(jī)制及如何精確地促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展仍不清楚。生物節(jié)律紊亂可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，惡性腫瘤的發(fā)生也可能影響生物鐘基因的表達(dá)。闡明生物鐘基因與惡性腫瘤的聯(lián)系，將有利于惡性腫瘤新治療策略的發(fā)展，并為臨床指導(dǎo)時(shí)辰治療、評(píng)估疾病預(yù)后等提供依據(jù)。將來(lái)，生物鐘基因有可能使時(shí)辰治療成為一種更為合理的腫瘤治療模式。