戴 丹 胡東輝 張建軍

(湖北省中山醫(yī)院肝病科，湖北 武漢 430033)

在我國(guó)，由于乙型肝炎病毒(HBV)高發(fā)病率，肝癌是第二大最常見(jiàn)的惡性腫瘤〔1，2〕。目前對(duì)晚期肝癌的治療選擇有限，研發(fā)有效的肝癌治療方法是非常有必要的。以樹(shù)突細(xì)胞(DC)為基礎(chǔ)免疫治療肝癌患者的研究表明DC接種和免疫治療可能是一個(gè)安全有效的肝癌治療方案〔3〕。已知每個(gè)T細(xì)胞亞群的分化和功能由特定的轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控，如Runx1和Runx3，這些TF在Th1與Th2激活或沉默細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄基因、γ干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素(IL)-4的過(guò)程中，Th直接與表達(dá)于T細(xì)胞的T-box(T-bet 和GATA3)相互作用〔4〕。與之相應(yīng)的特異性TF分別為T(mén)-bet和GATA-3。研究表明Th1/Th2細(xì)胞平衡或失衡在一些生理病理過(guò)程中起重要作用〔1，2，5〕，檢測(cè)這些細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的TF比值，即T-bet/GATA-3，會(huì)更客觀反映Th1/Th2細(xì)胞分化〔3,6〕。因此，研究Th1/Th2細(xì)胞在其TF水平的平衡結(jié)果將更為顯著。本研究中，我們采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)肝癌患者和健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的Th1-、Th2-特異性TF(分別為T(mén)-bet，GATA-3)mRNA表達(dá)水平，以闡明Th1/Th2細(xì)胞失衡與肝癌間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 湖北省中山醫(yī)院2014年1月至2015年1月初次診斷為肝癌并需外科手術(shù)治療的患者23例為肝癌組，體檢中心健康者21例為對(duì)照組，均無(wú)自身免疫性疾病(如糖尿病，甲狀腺功能亢進(jìn)等)和免疫治療等病史。肝癌組中有乙型肝炎病史者19例。與對(duì)照組相比，肝癌組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽固醇(TC)均顯著升高(P<0.05)。兩組年齡、性別、漢族比例、體重指數(shù)(BMI)、堿性磷酸酶(ALP)等無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般臨床特點(diǎn)

1.2方法 采集所有受試者的空腹外周靜脈血標(biāo)本，收集于真空血液收集管中，以乙二胺四乙酸(EDTA)為抗凝血?jiǎng)?，并于采樣? h內(nèi)完成樣本處理。

1.3主要儀器和試劑 ABI 7500自動(dòng)熒光定量PCR儀，ABI 9700 PCR儀和ABI 3900高通量DNA合成儀均購(gòu)自Applied Biosystems Inc.(美國(guó))。ELITE 200電泳設(shè)備和Dolphin-DO凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自WEALTEC(美國(guó))。RCO3000T-5-VBC CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵化器購(gòu)自KENDRO(美國(guó))。CK40-32PH倒置顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯(東京，日本)。Trizol法RNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa(日本)。反轉(zhuǎn)錄緩沖液(5×)，PCR緩沖液，Taq酶購(gòu)自達(dá)納基因(中國(guó)廣州)。人體淋巴細(xì)胞分離管購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)公司(中國(guó)深圳)。 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco(美國(guó))。

1.4PCR引物的設(shè)計(jì)和合成 在GenBank搜索靶基因(T-bet，GATA-3)的mRNA序列，采用Primer Express2.0軟件進(jìn)行基因引物設(shè)計(jì)。引物序列：T-bet上游引物：5'-CGGCTGCATATCGTTGAGGT-3'，下游引物：5'-GTCCCCATTGGCATTCCTC-3'，擴(kuò)增片段：107 bp；GATA-3上游引物：5'-TCATTA AGCCCAAGCGAAGG-3'，下游引物：5'-GTCCCCATTGGCATTCCTC-3'，擴(kuò)增片段：107 bp；β-actin上游引物：5'-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3'，下游引物：5'-TCGTCCCAGTTGGTGACG AT-3'，擴(kuò)增片段：106 bp。

1.5細(xì)胞總RNA提取和實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR) 用含有淋巴細(xì)胞分離液的淋巴細(xì)胞分離管分離外周靜脈血淋巴細(xì)胞。調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞至(1～5)×106/ml，并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育培養(yǎng)4～8 h，使細(xì)胞附著管壁。分離淋巴細(xì)胞，于離心機(jī)在12 000 r/min離心15 min，收集懸浮淋巴細(xì)胞。用Trizol試劑溶解沉淀細(xì)胞。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)從淋巴細(xì)胞中分離總RNA。4 μl模板RNA用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在ABI 9700進(jìn)行，條件：37℃保溫1 h，95℃ 3 min。5 μl反轉(zhuǎn)錄cDNA模板用于PCR反應(yīng)，采用ABI 7500自動(dòng)熒光定量PCR儀。用無(wú)菌雙蒸水用作陰性對(duì)照。PCR條件：93℃變性3 min，然后93℃ 30 s、55℃ 45 s和72℃ 45 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。PCR完成后，由計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算靶基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

肝癌組PBMC T-bet mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，GATA-3 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P=0.024)，T-bet mRNA/GATA-3 mRNA明顯低于對(duì)照組(P=0.031)，見(jiàn)表1。

表1 兩組T-bet、GATA-3 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

目前對(duì)晚期肝癌的治療選擇有限，研發(fā)有效的肝癌治療方法是非常有必要的。既往研究表明，Th1/Th2比例失衡可能導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如癌癥、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、內(nèi)分泌疾病、感染性疾病和器官移植排斥反應(yīng)〔7,8〕。正常情況下，Th1細(xì)胞，Th2細(xì)胞與Th17細(xì)胞結(jié)合，最終形成CD4+T效應(yīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)〔9〕。當(dāng)幼稚CD4+T細(xì)胞受外部抗原的刺激，其根據(jù)不同細(xì)胞因子的作用而增殖和分化成多種CD4+T效應(yīng)細(xì)胞。IL-12和IFN-γ誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。IL-12是決定CD4+T分化成Th1細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子，與其受體IL-12R的結(jié)合可誘導(dǎo)和激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄蛋白(STAT)4的活化，這可上調(diào)IFN-γ，并可激活STAT1和Th1細(xì)胞分化的特異TF-T-bet〔10〕。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和抗移植物反應(yīng)，并起到抗感染和抗腫瘤的重要作用。而IL-4可誘導(dǎo)活化的CD4+T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞。IL-4與其受體IL-4R結(jié)合，激活STAT6，也激活Th2細(xì)胞特異性的TF GATA-3〔11,12〕。Th2細(xì)胞分泌IL-4，IL-5和IL-13，這可調(diào)節(jié)體液免疫和過(guò)敏反應(yīng)，并參與系統(tǒng)性自身免疫性疾病的發(fā)生。

Th2型細(xì)胞因子在惡性皮膚癌患者表達(dá)顯著，而Th1型細(xì)胞因子則主要表達(dá)于良性皮膚癌患者〔13〕。此后，在許多惡性腫瘤中觀察到Th2型細(xì)胞因子，包括非小細(xì)胞肺癌、絨毛膜癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔14，15〕。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌外周血Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，顯示Th2型細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并有隨臨床分期及疾病惡化程度增加而增加的趨勢(shì)，表明Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)與原發(fā)性肝癌的進(jìn)展有關(guān)〔16〕。 TF GATA-3的優(yōu)勢(shì)表達(dá)也發(fā)生于乳腺癌和胰腺癌〔17，18〕。本研究表明，肝癌患者PMBC T-bet的表達(dá)降低而GATA-3的表達(dá)增加，T-bet/GATA-3比值顯著降低，且GATA-3表達(dá)顯著，顯示在轉(zhuǎn)錄水平存在Th2細(xì)胞漂移。Th2細(xì)胞漂移是癌細(xì)胞免疫逃逸的常見(jiàn)機(jī)制之一，且與癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和再發(fā)生有關(guān)。因此，糾正Th1/Th2細(xì)胞失衡可能是癌癥免疫療法的一個(gè)重要途徑。

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