楊學(xué)良 孫雪梅 趙曉暉 楊萬國 姜 靜 沈維高 夏雪怡 劉艷波

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132012)

慢性腸炎及腸息肉對直結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)揮重要作用，而炎癥過程中聚集的炎細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等)及其分泌的細(xì)胞因子與腸癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，目前研究較多的是細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17相關(guān)家族，目前與腫瘤關(guān)系研究最為密切的是IL-17A及IL-17受體(R)A〔1,2〕。IL-17A主要由Th17細(xì)胞分泌，此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞，腺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等也可分泌，存在于多種炎癥相關(guān)性腫瘤患者體內(nèi)〔3，4〕。IL-17RA也主要由Th17細(xì)胞分泌，IL-17A與IL-17RA結(jié)合，通過一定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程影響其下游基因的表達(dá)，然而在腸相關(guān)疾病中作用仍不明確。本研究探討IL-17A、IL-17RA和巨噬細(xì)胞在腸癌、腸息肉和腸炎中組織的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究所用標(biāo)本來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院和吉林市人民醫(yī)院。其中，腸炎15例，男11例，女4例，平均年齡(50±10.3)歲，腸息肉6例，男5例，女1例，平均年齡(55±13.4)歲，腸癌30例，男21例，女9例，平均年齡(60±14.5)歲。所有患者本人知情且有明確病理診斷，各項操作符合倫理學(xué)要求。

1.2主要儀器設(shè)備 顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、軟件處理圖像系統(tǒng)(美國Image pro plus出品)、電子天平、磁力攪拌器、酸度計、移液器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、滅菌鍋、臺式低速離心機(jī)等。

1.3主要試劑 實(shí)驗中使用抗IL-17A(免抗IgG，1∶150)、抗IL-17RA(山羊抗IgG，1∶200)、抗CD68(鼠抗IgG，1∶800)抗體分別購自Novus biological(美國)、Abcam(香港)Ltd(中國)、Santa Cruz有限公司(美國)，二抗為北京中杉金橋試劑公司提供的通用型PV9000試劑盒和山羊抗PV9003試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液由北京中杉金橋試劑公司生產(chǎn)，其他均為進(jìn)口及國產(chǎn)分析純試劑。

1.4免疫組織化學(xué)染色法檢測IL-17A、IL-17RA及巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)情況 標(biāo)本常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次3 min，蒸餾水沖洗2次后待用；利用高溫高壓法修復(fù)抗原(修復(fù)液為pH6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液)，冷卻至室溫后PBS漂洗3次；1% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶：滴加一抗常溫孵育過夜，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記，二抗加5%的血清),常溫孵育30 min,PBS漂洗后DAB顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，干燥，封片。當(dāng)棕黃色顆粒高于本底時定義為陽性。在200倍顯微鏡下連續(xù)拍攝每一張組織切片，在相同條件下通過Image pro plus軟件對圖片進(jìn)行平均光密度值分析。IL-17A和IL-17RA陽性計算方法為陽性面積占整個染色切片面積百分比。巨噬細(xì)胞浸潤密度的計算方法為單位面積(mm2)陽性細(xì)胞的個數(shù)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用Minitab Release9.2進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗。

2 結(jié) 果

IL-17A陽性顆粒呈棕黃色，主要表達(dá)于腸腺上皮、間質(zhì)內(nèi)單個核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分癌細(xì)胞中，見圖1。IL-17A在腸炎、腸息肉及腸癌組織中陽性表達(dá)率分別為6.35%±0.54%、9.33%±0.47%和2.82%±0.16%。與腸癌組織相比，IL-17A在腸炎和腸息肉中陽性率明顯增加(均P<0.01)；與腸炎組織相比，腸息肉中陽性率明顯增高(P<0.01)。IL-17RA陽性顆粒亦呈現(xiàn)棕黃色，主要表達(dá)于腺上皮，間質(zhì)內(nèi)單個核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分癌細(xì)胞內(nèi)，見圖2。IL-17RA在腸炎、腸息肉及腸癌組織中陽性表達(dá)率分別為4.65%±0.51%、5.03%±1.48%、2.12%±0.35%，與腸癌組織相比，腸炎及腸息肉中IL-17RA陽性表達(dá)率明顯增高(均P<0.05)。CD68+(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)細(xì)胞在腸炎、腸息肉及腸癌組織中主要浸潤于間質(zhì)，見圖3，其浸潤密度分別為(21.21±1.94)mm-2、(10.83±2.24)mm-2、(15.31±1.02)mm-2，三者間表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。腸癌組織中IL-17A的陽性表達(dá)與IL-17RA陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.844，P=0.000 1)；IL-17A陽性表達(dá)與巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.621,P=0.000 1)；而IL-17RA陽性表達(dá)與巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.750,P=0.000 1)。

圖1 IL-17A在腸相關(guān)疾病中的陽性表達(dá)(DAB，×200)

圖2 IL-17RA在腸相關(guān)疾病中的陽性表達(dá)(DAB，×200)

圖3 巨噬細(xì)胞在腸相關(guān)疾病中陽性表達(dá)(DAB，×200)

3 討 論

IL-17A在卵巢癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等腫瘤組織中有較高表達(dá),且預(yù)后不良〔5,6〕。本研究證實(shí)IL-17A及IL-17RA在腸炎組織中表達(dá)明顯增加，表明IL-17A及IL-17RA表達(dá)增加可引起炎癥細(xì)胞浸潤，而炎癥細(xì)胞浸潤又可釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，通過趨化作用加強(qiáng)這一反應(yīng)。這些炎癥細(xì)胞可表達(dá)及分泌IL-17A家族，包括IL-17A及其受體IL-17RA，上述多種細(xì)胞因子作用于腸黏膜組織，使得腸相關(guān)細(xì)胞不正常增殖，甚至造成息肉及癌癥的發(fā)生。本研究腸癌組織IL-17A及IL-17RA陽性表達(dá)較炎癥及息肉組織明顯降低，一方面可能是因為IL-17A及受體主要由由于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌，在腸炎組織內(nèi)，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，使得IL-17A及受體IL-17RA的表達(dá)明顯增加，另外，腸息肉主要由腺上皮的異常增生而發(fā)生，而IL-17A及IL-17RA也可由腺上皮細(xì)胞分泌，并且腸癌組織內(nèi)正常的腺上皮細(xì)胞發(fā)生改變，因損傷或不正常的結(jié)構(gòu)細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A及IL-17RA會相應(yīng)減少〔7〕。炎性微環(huán)境是腸道疾病的主要特征之一，可影響腸癌組織內(nèi)的血管形成，一方面，在腫瘤微環(huán)境中存在不同程度的炎癥，炎癥可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和存活，另外，腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)是腫瘤組織內(nèi)免疫反應(yīng)的重要因素，可決定腫瘤組織內(nèi)炎癥的促瘤或抑瘤作用〔8〕。腫瘤微環(huán)境中的促炎癥因子具有趨化炎癥細(xì)胞的作用，如T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。本研究表明，CD68+巨噬細(xì)胞在腸炎及腸癌中浸潤增加，表明其可能參與了腸炎及腸癌的發(fā)生及發(fā)展。巨噬細(xì)胞是炎癥及腫瘤組織內(nèi)最重要的組織部分，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用〔9〕。根據(jù)腫瘤類型的不同，它的作用相當(dāng)復(fù)雜，至今也未弄清。本研究表明巨噬細(xì)胞在腸癌及腸炎組織中浸潤增加，且與IL-17A及IL-17RA陽性表達(dá)呈正相關(guān)，暗示IL-17A及IL-17RA可能主要由巨噬細(xì)胞分泌。巨噬細(xì)胞通過自分泌途徑分泌IL-17A及IL-17RA，在腸癌發(fā)展中的作用需要深入研究。

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8Solinas G,Germano G,Mantovani A,etal.Tumor-associated macrophages(TAM) as major players of the cancer-related inflammation〔J〕.J Leukoc Biol,2009;86(5):1065-73.

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