蘇立寧 宋小青 朱登祥 魏會平 王 睿

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000)

干細(xì)胞誘導(dǎo)和細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)、再生和功能恢復(fù)提供了新的有潛力的治療手段。胚胎干細(xì)胞具有定向誘導(dǎo)分化難以控制、供體來源困難、異體排斥反應(yīng)等缺點。神經(jīng)干細(xì)胞是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的良好“種子”細(xì)胞，但多從胚胎或成熟的中樞系統(tǒng)取材培養(yǎng)，也制約了細(xì)胞的來源，如歐洲已明確規(guī)定禁止從人胚胎中獲取干細(xì)胞。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)〔1〕可以解決上述問題，因此間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和體內(nèi)移植成為這一領(lǐng)域的研究熱點。已有研究證實BMSCs是治療缺血性腦疾病、帕金森病、脊髓損傷、坐骨神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞，這方面研究可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療提供較好的理論和實驗依據(jù)〔2～5〕。在合適的誘導(dǎo)條件下，BMSCs可向多種細(xì)胞及神經(jīng)樣細(xì)胞分化〔1，6～10〕。目前國內(nèi)外對BMSCs分化和神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的研究主要集中在BMSCs體外誘導(dǎo)分化及體內(nèi)移植實驗，關(guān)于BMSCs可定向誘導(dǎo)向神經(jīng)樣細(xì)胞分化已經(jīng)取得了不少成果〔11～15〕。川芎嗪對腦損傷的保護及其作用機制成為研究熱點〔16～18〕。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以保護缺血性腦損傷、減輕神經(jīng)元凋亡，與促進神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達有關(guān)〔19〕。BDNF高表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其發(fā)育過程中具有調(diào)控神經(jīng)元的存活、分化、生長及保護神經(jīng)元免受損傷，改善神經(jīng)元病理狀態(tài)等作用，是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需〔20～22〕。本研究觀察川芎嗪聯(lián)合BDNF誘導(dǎo) BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。

1 材料和方法

1.1材料 健康SD大鼠4只，4周齡，體質(zhì)量(90±20)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物繁殖中心提供。DMEM/F12(GIBCO公司)、BDNF(GenScript公司)、RNA提取試劑盒、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)引物(TaKaRa公司)、兔抗巢蛋白(nestin)、兔抗NSE(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、川芎嗪(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)。

1.2BMSCs的分離及培養(yǎng) 原代培養(yǎng)：無菌條件下取SD大鼠股骨和脛骨，采用D-Hanks液多次沖洗多余血液，采用含1%的雙抗(青、鏈霉素)+10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，得到細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后首次半換液，以后每2天換液一次。傳代培養(yǎng)：待細(xì)胞密度達到80%～90%時，0.25%的胰酶消化進行傳代。通過傳代，細(xì)胞逐漸純化，至第3代后，細(xì)胞純度較高。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并拍照記錄。

1.3BMSCs表面標(biāo)志的檢測 取第3代大鼠BMSCs與熒光標(biāo)記的抗鼠CD29，CD34，CD45，CD90混合，37℃作用30 min后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度。

1.4BDNF和川芎嗪聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs的分化 取第3代BMSCs，胰酶消化后按 3×105/ml濃度接種于放置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，制備細(xì)胞爬片分為4組進行誘導(dǎo)。對照組：不加任何誘導(dǎo)劑；BDNF組：加入100 ng/ml BDNF；川芎嗪組：加入1.25 mg/ml川芎嗪；BDNF聯(lián)合川芎嗪組前2 d加100 ng/ml BDNF，后2 d加1.25 mg/ml川芎嗪。每個實驗組均誘導(dǎo)4 d。

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定BMSCs的分化 每個實驗組采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察nestin、NSE的表達，顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照。免疫細(xì)胞化學(xué)方法如下：取出細(xì)胞爬片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，冷丙酮固定10 min，PBS洗3次，每次3 min；將蓋玻片浸入3%H2O2中，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；用試劑A(正常山羊血清)封閉20 min，吸棄，不予漂洗；分別滴加稀釋后的Nestin、NSE抗體(1∶200稀釋度)置入濕盒中4℃過夜，PBS漂洗3次，每次3 min；加入試劑B(生物素標(biāo)記的二抗)，37℃孵育15～20 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴入試劑C，室溫或37℃孵育15～20 min，PBS漂洗3次，每次3 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色10 min，自來水沖洗終止反應(yīng)，中性樹膠封片。

1.6實時熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)前后NSE mRNA表達 根據(jù)GenBank公布的基因序列設(shè)計引物，由上海生工合成。NSE引物正義鏈：GTATGGATGTGGCTGCCTCTG，反義鏈：TCCTGGTCGAATGGGTCTTC。采用 SYBR Green Ⅰ熒光染料法進行實時定量 RT-PCR 擴增的檢測。PCR反應(yīng)體系為20 μl，置于實時熒光定量PCR儀中擴增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，72℃檢測信號。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1誘導(dǎo)前大鼠BMSCs細(xì)胞的形態(tài)觀察 原代培養(yǎng)2 d后倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞少量呈群落生長，形態(tài)大多呈短梭形；4～6 d細(xì)胞形態(tài)大多呈長梭形或呈多邊形，細(xì)胞集落不斷擴大，呈群落生長。胰酶消化傳代，二代、三代細(xì)胞生長較穩(wěn)定，密度較均勻，形態(tài)以長梭形為主，符合BMSCs的細(xì)胞形態(tài)特征(圖1)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：CD29，CD90表達陽性，陽性率分別為99.8%，88.6%；CD34，CD45表達陰性，陽性率分別為1.8%，23.3%。

2.2加入誘導(dǎo)劑后BMSCs的形態(tài)學(xué)變化 處理4 d后，對照組細(xì)胞形態(tài)沒有任何變化；BDNF聯(lián)合川芎嗪，4 d后出現(xiàn)較多神經(jīng)樣細(xì)胞，細(xì)胞體積增大，胞核固縮，核質(zhì)比降低，細(xì)長突起明顯，部分細(xì)胞間以網(wǎng)絡(luò)狀連接；而BDNF組和BDNF聯(lián)合川芎嗪組可見到少量神經(jīng)樣細(xì)胞(圖2)。

圖1 誘導(dǎo)前大鼠BMSCs形態(tài)(倒置相差顯微鏡，×100)

圖2 BMSCs形態(tài)學(xué)變化(×100)

2.3BMSCs分化的鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)4 d后，對照組細(xì)胞nestin和NSE標(biāo)記陰性，BDNF聯(lián)合川芎嗪組nestin和NSE標(biāo)記陽性(圖3)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，對照組為0.615±0.006，BDNF組0.719±0.006，川芎嗪組為0.727±0.005，BDNF聯(lián)合川芎嗪組為1.586±0.003。BDNF聯(lián)合川芎嗪組細(xì)胞的NSE 基因表達量顯著高于對照組、BDNF組及川芎嗪組。

圖3 BMSCs分化鑒定結(jié)果

3 討 論

BMSCs是骨髓微環(huán)境的重要組成部分，在體內(nèi)分布于多種組織器官，體外在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為各種細(xì)胞，其中包括神經(jīng)樣細(xì)胞。目前，BMSCs具有自我更新和多向分化潛能的特性已經(jīng)被廣泛認(rèn)知。一些學(xué)者用 β-巰基乙醇〔23〕、二甲基亞砜、4-羥基茴香烷〔24〕、丁基化酚酮等化學(xué)試劑，體外成功誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，但由于化學(xué)試劑的毒性作用，很難應(yīng)用于臨床治療。近年研究表明使用丹參、多糖、黃芪類、紅景天苷、銀杏內(nèi)酯、鹿茸多肽和白藜蘆醇等藥或其提取物可誘導(dǎo) BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，并表達多種神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物〔25～32〕。藥理學(xué)的研究認(rèn)為，上述藥物的誘導(dǎo)作用可能和藥物的抗氧化作用有關(guān)。川芎嗪是一種已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)科和心血管內(nèi)科等領(lǐng)域的傳統(tǒng)中藥提取物，其提取物藥理作用較廣泛，具有抗氧化、清除氧自由基、保護神經(jīng)細(xì)胞等作用，因此川芎嗪具有誘導(dǎo)BMSCs 定向分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的潛能。細(xì)胞的分化還受各種細(xì)胞因子的影響，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用尤為關(guān)鍵。BDNF參與調(diào)控神經(jīng)結(jié)構(gòu)及功能變化，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和長期記憶中發(fā)揮重要作用，分泌后與其受體酪氨酸激酶受體B結(jié)合產(chǎn)生一系列信號途徑，保護神經(jīng)元、促進損傷神經(jīng)再生〔31，33，34〕。Lim等〔35〕將BDNF添加入神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成功誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)分化，分化過程與MAPK/ERK和PI3K/Akt信號有關(guān)。Han等〔36，37〕在體外將BDNF基因轉(zhuǎn)入BMSCs，與普通的BMSCs相比，BDNF/BMSCs表現(xiàn)出更高的增殖能力，分泌更多的BDNF，明顯提高向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的比率。BDNF在腦內(nèi)表達量尤為顯著，對發(fā)育中中樞神經(jīng)的存活、分化及增殖具有促進作用，防止神經(jīng)元退行性變，還能抗細(xì)胞凋亡。本實驗中，BDNF聯(lián)合川芎嗪組神經(jīng)樣細(xì)胞的存活時間明顯比川芎嗪單體誘導(dǎo)組要長，可能與上述機制有關(guān)，BDNF延長了神經(jīng)樣細(xì)胞的存活時間。微小RNA(miRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小20～25個核苷酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。近年來，對于miRNA在神經(jīng)細(xì)胞分化中所起作用的研究成為神經(jīng)誘導(dǎo)中的研究熱點之一，最近有研究發(fā)現(xiàn)在亨廷頓舞蹈病患者體內(nèi)，神經(jīng)功能紊亂和死亡均會導(dǎo)致miR-10b-5p表達量上升，其靶基因BDNF表達量降低，BDNF與miR-10b-5p共同調(diào)控神經(jīng)的功能及存活〔38〕，從另一方面為尋找BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子提供基礎(chǔ)。綜上所述，BDNF在神經(jīng)細(xì)胞分化中發(fā)揮了重要作用，是神經(jīng)分化及生長不可缺少的因子。

1Biver G，Wang N，Gartland A，etal.Role of the P2Y13 receptor in the differentiation of bone marrow stromal cells into osteoblasts and adipocytes〔J〕.Stem Cells，2013；31(12)：2747-58.

2Chen CJ，Qu YC，Liao SL，etal.Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair〔J〕.Exp Neurol，2007；204(1)：443-53.

3Zheng L,Cui HF.Use of chitosan conduit combined with bone marrow mesenchymal stem cells for promoting peripheral nerve regeneration〔J〕.J Mater Sci，2010；21(5)：1713-6.

4Jia H，Wang Y，Tong XJ，etal.Sciatic nerve repair by acellular nerve xenografts implanted with BMSCs in rats xenograft combined with BMSCs〔J〕.Synapse，2012；66(3)：256-69.

5Wang Y，Jia H，Li WY，etal.Synergistic effects of bone mesenchymal stem cells and chondroitinase ABC on nerve regeneration after acellular nerve allograft in rats〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2012；32(3)：361-71.

6馮 敏，孫榮青，馬愛群.體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化的研究〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2009；21(6)：340-2.

7趙 瑛，蔡紹皙.鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2010；26(1)：60-5.

8Feng Z，Li C，Jiao S，etal.In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes〔J〕.Hepatogastroenterology，2011；58(112)：2081-6.

9Wei B，Jin C，Xu Y，etal.Chondrogenic differentiation of marrow clots after microfracture with BMSC-derived ECM scaffold in vitro〔J〕.Tissue Eng Part A，2014；20(19)：2646-55.

10Wang T，Yang X，Qi X，etal.Osteoinduction and proliferation of bone-marrow stromal cells in three-dimensional poly (epsilon-caprolactone)/ hydroxyapatite/collagen scaffolds〔J〕.J Transl Med，2015；13(1)：152.

11Lei Z，Yongda L，Jun M，etal.Culture and neural differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro〔J〕.Cell Biol Int，2007；31(9)：916-23.

12柴立輝，吳素霞，鄢文海，等.體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的研究〔J〕.生物工程學(xué)報，2007；23(2)：252-6.

13Huat TJ，Khan AA，Abdullah JM，etal.MicroRNA expression profile of neural progenitor-like cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells under the influence of IGF-1，bFGF and EGF〔J〕.Int J Mol Sci，2015；16(5)：9693-718.

14李 博，黃春田，李彩芳，等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化后自噬水平的變化〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015；31(1)：31-4.

15Zhu T，Yu D，F(xiàn)eng J，etal.GDNF and NT-3 induce progenitor bone mesenchymal stem cell differentiation into neurons in fetal gut culture medium〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2015；35(2)：255-64.

16Fan LH，Wang KZ，Cheng B，etal.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of tetramethylpyrazine following spinal cord ischemia in rabbits〔J〕.BMC Neurosci，2006；7(1)：48-57.

17Kao TK，Ou YC，Kuo JS，etal.Neuroprotection by tetramethylpyrazine against ischemic brain injury in rats〔J〕.Neurochem Int，2006；48(3)：166-76.

18Tan Z.Neural protection by naturopathic compounds-an example of tetramethylpyrazine from retina to brain〔J〕.J Ocul Biol Dis Infor，2009；2(3)：57-64.

19馬 潞，劉文科，張躍康，等.川芎嗪對重型腦損傷組織BDNF、bFGF表達的影響及對神經(jīng)元的保護作用〔J〕.四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008；39(2)：207-10.

20Ivanov AD.The role of NGF and BDNF in mature brain activity regulation〔J〕.Zh Vyssh Nerv Deiat Im I P Pavlova，2014；64(2)：137-46.

21Baydyuk M，Wu XS，He L，etal.Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation，exocytosis，and endocytosis at a central nerve terminal〔J〕.J Neurosci，2015；35(11)：4676-82.

22Hannan JL，Albersen M，Stopak BL，etal.Temporal changes in neurotrophic factors and neurite outgrowth in the major pelvic ganglion following cavernous nerve injury〔J〕.J Neurosci Res，2015；93(6)：954-63.

23Wu R，Wang N，Li M，etal.Experimental study on the facilitative effects of miR-125b on the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells〔J〕.Cell Biol Int，2013；37(8)：812-9.

24Kaka GR，Tiraihi T，Delshad A，etal.In vitro differentiation of bone marrow stromal cells into oligodendrocyte-like cells using triiodothyronine as inducer〔J〕.Int J Neurosci，2012；122(5)：237-47.

25胡琳燕，余加林，劉官信，等.丹參誘導(dǎo)鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞優(yōu)化方案及電生理研究〔J〕.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008；30(3)：392-6.

26納 鑫，汪雪蘭，皮榮標(biāo).川芎嗪對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用及其機制的研究進展〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2008；19(1)：77-80.

27王旭凱，王 英，楊有庚，等.鹿茸多肽對β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的保護作用〔J〕.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009；33(1)：45-7.

28范洪偉，鄧春榮，付 健，等.枸杞多糖對大鼠坐骨神經(jīng)離斷后創(chuàng)傷性神經(jīng)瘤形成及其疼痛影響〔J〕.中國修復(fù)重建外科雜志，2010；24(11)：1298-301.

29杜曉鳴，魏會平，張愛蘭，等.川芎嗪對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞長期誘導(dǎo)效應(yīng)的研究〔J〕.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2012；10(13)：157-8.

30陸 燕，劉 沙，劉 的，等.銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012；12(15)：2826-8.

31Ma J，Zhang Z，Su Y，etal.Magnetic stimulation modulates structural synaptic plasticity and regulates BDNF-TrkB signal pathway in cultured hippocampal neurons〔J〕.Neurochem Int，2013；62(1)：84-91.

32黃家貴，沈長波，劉 舒，等.白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化伴Shh信號激活〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013；35(4)：280-3.

33Jeon SJ，Rhee SY，Seo JE，etal.Oroxylin A increases BDNF production by activation of MAPK-CREB pathway in rat primary cortical neuronal culture〔J〕.Neurosci Res，2011；69(3)：214-22.

34Revest JM，Le Roux A，Roullot-Lacarriere V，etal.BDNF-TrkB signaling through Erk1/2 MAPK phosphorylation mediates the enhancement of fear memory induced by glucocorticoids〔J〕.Mol Psychiatry，2014;19(9)：1001-9.

35Lim JY，Park SI，Oh JH，etal.Brain-derived neurotrophic factor stimulates the neural differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and survival of differentiated cells through MAPK/ERK and PI3K/Akt-dependent signaling pathways〔J〕.J Neurosci Res，2008;86(10)：2168-78.

36Han ZM，Huang HM，Wang FF.Brain-derived neurotrophic factor gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.Exp Ther Med，2015；9(2)：519-22.

37Liu Q，Cheng G，Wang Z，etal.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiate into nerve-like cells in vitro after transfection with brain-derived neurotrophic factor gene〔J〕.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2015；51(3)：319-27.

38Muller S.In silico analysis of regulatory networks underlines the role of miR-10b-5p and its target BDNF in huntington′s disease〔J〕.Transl Neurodegener，2014；3(1)：17-21.