楊建博 焦甲勛 趙 磊 武佳奇 閆廣輝 靳憲輝 劉 斌 尚紅濤

(哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院骨二科，河北 衡水 053000)

骨肉瘤具有較高的發(fā)病率，易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，疾病進(jìn)展較快〔1，2〕。近年來，臨床上主要采取手術(shù)和新輔助化療的方式治療，其中化療是治療骨肉瘤的重要組成部分，但已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者對(duì)化療的敏感性差，易引起化療毒性反應(yīng)、心力衰竭等并發(fā)癥，5年生存率仍然較低〔3〕。因此，探索新的治療方法成為骨肉瘤研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。他莫西芬又叫三苯氧胺，是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，結(jié)合并部分激動(dòng)雌激素受體α，也可完全拮抗雌激素受體β〔4〕。研究表明，他莫西芬能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，從而阻礙乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展〔5〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)他莫西芬可作為一種化療增敏劑增強(qiáng)雌激素受體陽性腫瘤非性激素靶器官的化療敏感性并對(duì)細(xì)胞的耐藥性具有一定的逆轉(zhuǎn)作用，從而提高化療的滿意度〔6，7〕。本研究通過分析他莫西芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，探討其作用機(jī)制和臨床意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司，MTT試劑、他莫西芬購自美國Sigma公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海Solarbio公司，Matrigel基質(zhì)膠、Transwell侵襲小室購自美國BD公司，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、MMP-9抗體、β-肌動(dòng)蛋白(actin)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，購自北京金橋生物公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備公司，移液器購自德國Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，3～4周齡，體重(60±3)g，購自南京鵬晟生物公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞MG-63培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清和雙抗，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，無菌吸管吸取培養(yǎng)基，加入3 ml 0.25%胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞間距，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)，按1∶3的比例進(jìn)行傳代，置于培養(yǎng)箱中。

1.3MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖情況 0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×103個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸浮液加入 96孔培養(yǎng)板上，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入200 μl不同濃度的他莫西芬處理細(xì)胞，他莫西芬的濃度分別為1、2、4、8、16 μmol/L，未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，每孔5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μl二甲基亞砜 (DMSO)，振蕩混勻10 min，檢測(cè)570 nm波長處的吸光度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況 收集16 μmol/L他莫西芬處理的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，采用200 μl Annexin V-FITC緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后置避光處反應(yīng)15 min，加入10 μl PI，避光反應(yīng)5 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基將Matrigel膠稀釋為20 g/ml，取50 μl稀釋好的Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室膜中，37℃放置2 h，備用。將細(xì)胞使用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，胰酶消化，加入新鮮無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取2.5×105個(gè)細(xì)胞加入上室中，下室中加入500 μl完全培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用無菌濕棉擦去基質(zhì)膠和小室膜表面細(xì)胞，預(yù)冷的甲醛固定30 min，蘇木素染色1 min，隨機(jī)選取6個(gè)視野，在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.6Western印跡檢測(cè)MMP-9、MMP-2蛋白的表達(dá) PBS漂洗2次，收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，在冰上放置30 min，離心，所得上清即為細(xì)胞中總蛋白。BAC法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，100℃煮沸10 min使蛋白質(zhì)充分變性。提前配置5 ml 10%的SDS-PAGE分離膠和2 ml 5% SDS-PAGE濃縮膠，每孔加入15 μl樣品蛋白，40 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，將電壓調(diào)整為60 V電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。切除多余凝膠，與硝酸纖維素膜、目的蛋白凝膠均置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡，200 mA電流作用90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，將攜帶目的蛋白的硝酸纖維素膜放入封閉液中封閉1 h。加入一抗，4℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育振蕩60 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光劑，暗室中曝光、顯影、定影，沖洗晾干，以β-actin為參照，Quantity One分析蛋白質(zhì)的灰度值。

1.7動(dòng)物造模及藥物干預(yù) PBS漂洗對(duì)數(shù)期細(xì)胞，使用不含血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107/ml，使用1 ml注射器于裸鼠左右后肢脛骨結(jié)節(jié)處穿刺至骨髓腔接種細(xì)胞懸浮液0.2 ml/只，接種后6～12 d，在接種部位出現(xiàn)腫瘤包塊，而且隨著時(shí)間逐漸增大大鼠出現(xiàn)明顯跛行認(rèn)為造模成功。將造模成功的裸鼠隨機(jī)分為兩組：模型組和給藥組。根據(jù)小鼠體重計(jì)算給藥劑量，模型組給予0.2 ml/只蒸餾水，給藥組給予3.6 mg/kg他莫西芬，連續(xù)給藥21 d，測(cè)量腫瘤體積變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件，兩組比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異使用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1他莫西芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組(0.689±0.052)相比，濃度分別為1、2、4、8、16 μmol/L他莫西芬組細(xì)胞的吸光值(0.564±0.043，0.462±0.041，0.398±0.022，0.291±0.027，0.158±0.023)顯著降低(F=81.395，P=0.000；t1=4.199，t2=7.625，t3=9.775，t4=13.369，t5=17.837，均P<0.05)，表明在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞的增殖與藥物的濃度具有顯著的劑量依賴性。

2.2他莫西芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組〔(3.569±0.286)%〕相比，骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)他莫西芬作用后凋亡率〔(23.623±3.588)%〕顯著增加(t=9.650，P<0.05)，表明他莫西芬可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

2.3他莫西芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲以及侵襲相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)他莫西芬作用后侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(t=13.267，P<0.05)；他莫西芬干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞后可降低細(xì)胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量(t1=5.324，t2=5.782，P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 他莫西芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量的影響

組別侵襲細(xì)胞(個(gè))MMP-9蛋白MMP-2蛋白對(duì)照組65.258±4.6741.233±0.1961.452±0.217他莫西芬組20.415±3.5251)0.589±0.0741)0.674±0.0851)

與對(duì)照組相比：1)P<0.05

2.4他莫西芬對(duì)裸鼠腫瘤體積的影響 與模型組〔(8.326±1.269)cm3〕相比，造模成功后給予他莫西芬可顯著抑制腫瘤體積的增大〔(3.452±0.895)cm3,t=5.436，P<0.05〕，表明他莫西芬可抑制骨肉瘤腫瘤的生長。

3 討 論

雖然骨肉瘤的治療手段不斷進(jìn)步，提高了原發(fā)骨肉瘤患者的5年生存率，但由于骨肉瘤具有較高的侵襲、遷移能力，易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移如肺轉(zhuǎn)移〔8〕。骨肉瘤伴肺轉(zhuǎn)移患者的5年生存率顯著降低，成為導(dǎo)致骨肉瘤患者死亡的最重要的原因〔9〕。因此，干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲等特性成為研究骨肉瘤預(yù)防和治療的熱點(diǎn)之一。由于副作用較小，他莫西芬常作為一種非甾體類選擇性雌激素受體治療惡性腫瘤〔10〕。他莫西芬可與雌激素受體結(jié)合，對(duì)不同的腫瘤組織表現(xiàn)不同的作用。雌激素的靶器官主要有乳腺和子宮，因此近年來他莫西芬常用來治療乳腺癌和子宮癌并取得了較好的療效〔11〕。在雌激素受體陽性的乳腺癌組織中，他莫西芬主要通過拮抗雌激素受體，阻礙其信號(hào)傳導(dǎo)，從而阻斷細(xì)胞的分裂，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)他莫西芬不僅對(duì)雌激素受體陽性的癌癥有重要作用，還可抑制雌激素受體陰性的惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如胰腺癌、黑色素瘤等〔13，14〕。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度他莫西芬干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞，其細(xì)胞的增殖受到抑制，且具有一定的濃度依賴性；骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)他莫西芬處理后凋亡率增加，侵襲能力降低；他莫西芬可抑制腫瘤體積的增加，提示他莫西芬可抑制骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。

MMPs是一類降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的生物酶。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，參與多種腫瘤的侵襲、遷移過程〔15，16〕。在骨肉瘤中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)量增加，提示MMP-2和MMP-9可能參與骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、遷移過程〔17〕。同時(shí)，MMP-2和MMP-9不僅降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，還可促進(jìn)毛細(xì)血管的生長，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔18〕。本實(shí)驗(yàn)中Western印跡的結(jié)果也提示他莫西芬可能通過降低侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，他莫西芬可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，可能通過降低MMP-9、MMP-2蛋白的表達(dá)抑制其侵襲能力，對(duì)骨肉瘤的治療和預(yù)后有重要意義。

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