李圓圓 石春花 石明雋 張昌志 曾令萍 肖 瑛 郭 兵

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

Wnt信號(hào)通路在各種器官纖維化上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)過(guò)程中扮演重要作用，該信號(hào)通路的異常激活與心臟、腎臟、肺等器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1～3〕。Wnt4是Wnt家族蛋白之一，對(duì)泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)展至關(guān)重要〔4〕。阿托伐他汀是新近使用的高效他汀類(lèi)降脂藥物，有研究提示，他汀類(lèi)可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗炎、抗纖維化等腎臟保護(hù)作用〔5〕，但具體機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察阿托伐他汀藥物對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠Wnt4/β-catenin信號(hào)通路的影響，探討阿托伐他汀改善腎纖維化的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK 2007-0005。

1.2試劑 阿托伐他汀鈣片(阿樂(lè)，北京嘉林藥業(yè))，牛血清蛋白、超敏電化學(xué)發(fā)光法(ECL)、一抗稀釋液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京碧云天)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、兔抗-E-cadherin、兔抗-α-平滑肌自身抗體(SMA，武漢博士德)，兩步法免疫組化檢測(cè)試劑、辣根過(guò)氧化物標(biāo)記羊抗兔IgG，鼠抗-β-actin(北京中杉金橋)，兔抗-β-catenin、兔抗-Wnt4(北京博奧森公司)，兔抗-糖原合成激酶(GSK)-3β、兔抗-p-GSK-3β(美國(guó)Santa Cruz)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1UUO大鼠模型復(fù)制 參考薛痕等〔6〕方法，采用8%水合氯醛，按5 ml/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，劍突下4 cm做腹正中切口(約5 cm)，鈍性分離皮下組織及肌層，展開(kāi)止血鉗托住輸尿管中上段，4-0號(hào)絲線在相距1 cm的距離分別結(jié)扎輸尿管的兩端，從結(jié)扎兩端的中點(diǎn)位置將輸尿管剪斷，縫合皮膚。術(shù)后1～2 h大鼠清醒，6 h后給予進(jìn)水，12 h后予進(jìn)食。

1.3.2分組 將60只SD大鼠，雌雄各半，在清潔條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，常規(guī)飲食飲水。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和阿托伐他汀組，各組又分別設(shè)有7 d組和14 d組，每組10只。治療組術(shù)前3 d予10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀生理鹽水混懸液2 ml灌胃，假手術(shù)組及模型組予等體積生理鹽水灌胃。分別于術(shù)后7 d、14 d處死各組大鼠，取術(shù)側(cè)腎，常規(guī)固定，制片，染色。

1.3.3腎組織形態(tài)學(xué)檢查 4%中性甲醛固定腎臟組織制成3 μm厚石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，PAS染色和Masson染色觀察腎組織纖維化病變。

1.3.4免疫組化染色 制備好的大鼠腎組織石蠟切片采用兩步法免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行免疫組化染色，鏡下觀察Wnt4和β-catenin蛋白在大鼠腎組織表達(dá)。

1.3.5Western印跡檢測(cè) 按組織裂解液說(shuō)明書(shū)步驟提取蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取相應(yīng)量的蛋白液和1.5倍SDS配置成統(tǒng)一濃度樣品，混勻后100℃加熱10 min，保存于-20℃?zhèn)溆?，使用前煮? min，上樣，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗過(guò)夜，分別為：GSK-3β(1∶500)、p-GSK-3β(1∶600)、Wnt4(1∶200)、β-catenin(1∶300)、α-SMA(1∶200)、E-cadherin(1∶150)、Collagen-1(1∶200)、β-actin(1∶400)，TBST洗膜5 min 3次。孵育特定二抗1 h，洗膜后ECL顯影曝光。檢測(cè)各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腎組織病理學(xué)改變 HE、PAS染色見(jiàn)假手術(shù)組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管排列緊密，腎小管周?chē)g質(zhì)無(wú)增寬，模型各組大鼠術(shù)后7 d起觀察到腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管周?chē)g質(zhì)增寬、水腫并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)更加嚴(yán)重。但梗阻早期腎小球結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，阿托伐他汀組較同期模型組上述病變有所改善。Masson染色見(jiàn)假手術(shù)組腎小球基底膜、系膜區(qū)及腎小管間質(zhì)無(wú)明顯膠原沉積，模型組見(jiàn)增寬的間質(zhì)充滿(mǎn)著大量藍(lán)紫色條索狀膠原，隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)加重。阿托伐他汀組較同期模型組膠原沉積減少，見(jiàn)圖1。

圖1 HE、PAS和Masson染色觀察各組腎組織14 d形態(tài)學(xué)改變(×200)

2.2免疫組化學(xué)染色結(jié)果 假手術(shù)組腎組織中未見(jiàn)Wnt4表達(dá)，β-catenin蛋白僅少量表達(dá)于腎組織中細(xì)胞與細(xì)胞的連接處，模型組Wnt4高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，β-catenin蛋白在腎小管上皮細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(dá)，阿托伐他汀組Wnt4的表達(dá)明顯減少，β-catenin蛋白表達(dá)較同期的模型組減少。見(jiàn)圖2。

圖2 Wnt4和β-catenin在各組腎組織表達(dá)(DAB，×400)

2.3Wnt4和β-catenin蛋白在大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá) Wnt4和β-catenin蛋白在假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá)極少，UUO成模7 d后，Wnt4和β-catenin蛋白表達(dá)開(kāi)始增多(P<0.05)，成模14 d表達(dá)進(jìn)一步增高，明顯高于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P<0.05)； 阿托伐他汀組7 d時(shí)Wnt4和β-catenin 蛋白表達(dá)與同期模型組無(wú)明顯變化(P>0.05)，阿托伐他汀組14 d時(shí)，Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)較同期模型組顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表1。

1～5：假手術(shù)組、模型組7 d、阿托伐他汀組7 d、模型組14 d、阿托伐他汀組14 d，下圖同圖3 Wnt4和β-catenin蛋白在各組大鼠腎皮質(zhì)的相對(duì)表達(dá)

2.4GSK-3β和p-GSK-3β蛋白質(zhì)大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá) GSK-3β蛋白在各組大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，p-GSK-3β蛋白在假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)中無(wú)表達(dá)，與假手術(shù)組相比，模型組7 d時(shí)p-GSK-3β蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01)，14 d時(shí)p-GSK-3β蛋白仍維持在高于假手術(shù)組(P<0.01)；與同期模型組相比，在阿托伐他汀組7 d時(shí)p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯減少，14 d時(shí)p-GSK-3β蛋白的表達(dá)較同時(shí)點(diǎn)模型組減少更顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表1。

圖4 p-GSK-3β/GSK-3β蛋白在各組大鼠腎皮質(zhì)表達(dá)

2.5E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白在腎皮質(zhì)的表達(dá) 假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)E-cadherin蛋白呈高表達(dá)，α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白無(wú)表達(dá)，與假手術(shù)組相比，UUO成模7 d時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01)，α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01)，UUO 14 d時(shí)α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多(P<0.01)；與模型組7 d相比，給予阿托伐他汀治療7 d后E-cadherin蛋白的表達(dá)有所增多，α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表達(dá)有所下降，但均不顯著，治療14 d后與同期模型組相比E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯多(P<0.05)，α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖5。

表1 阿托伐他汀對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠Wnt4及相關(guān)蛋白表達(dá)影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組7 d比較：3)P<0.05；與模型組14 d比較：4)P<0.05

圖5 E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白在各組大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá)

3 討 論

腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)與共同通路，涉及機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未充分闡明。研究認(rèn)為EMT是腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制，在各種刺激因素的作用下，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失調(diào)及間質(zhì)細(xì)胞的增殖凋亡失衡是腎小管間質(zhì)纖維化的重要原因〔7〕，故抑制EMT的發(fā)生和減少ECM的沉積對(duì)延緩慢性腎病纖維化的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。 EMT作為腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制，其發(fā)生發(fā)展受多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及信號(hào)通路的共同調(diào)節(jié)。近年研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化EMT的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用〔8〕。β-catenin為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心分子，在沒(méi)有Wnt 信號(hào)作用時(shí)，β-catenin能被胞質(zhì)內(nèi)中由GSK-3β、結(jié)腸腺瘤性息肉蛋白(APC)、軸蛋白(Axin)等構(gòu)成的破壞復(fù)合體中的GSK3β磷酸化，磷酸化后的β-catenin可被E3泛素連接酶識(shí)別進(jìn)而被蛋白酶體泛素化降解，從而使胞內(nèi)游離的β-catenin處于相對(duì)較低的水平，阻止了Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)；在有Wnt信號(hào)時(shí)，Wnt 信號(hào)傳入胞內(nèi)與細(xì)胞表面受體Frizzled和共受體 LRP5/6 結(jié)合，使胞質(zhì)中的Dsh發(fā)生活化，經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)傳遞使β-catenin的破壞復(fù)合體中有活性的GSK-3β發(fā)生磷酸化生成無(wú)活性的p-GSK-3β蛋白，p-GSK-3β不能使β-catenin蛋白發(fā)生磷酸化，逃脫磷酸化的β-catenin蛋白在胞質(zhì)中不斷積累，到一定量后發(fā)生核轉(zhuǎn)移與核轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)相結(jié)合，調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游致纖維效應(yīng)靶基因的表達(dá)〔9〕，促進(jìn)UUO大鼠腎臟EMT的發(fā)生和腎間質(zhì)ECM的沉積。

阿托伐他汀是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成關(guān)鍵酶羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，能抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，同時(shí)還通過(guò)受體途徑促進(jìn)肝臟對(duì)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的攝取，使血膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平降低，因而被廣泛用于動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等血管疾病的防治中。近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物不僅具有降脂的作用，同時(shí)還具有抗氧化、抗炎腎臟保護(hù)作用等非降脂途徑作用。彭紅霞等〔10〕在UUO模型研究中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可能通過(guò)減少PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，減輕轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1致纖維化效應(yīng)，改善腎臟纖維化病變。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活在UUO大鼠腎纖維化發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用,阿托伐他汀通過(guò)多種途徑抑制肺、心肌等纖維化發(fā)生也有相關(guān)報(bào)道〔11,12〕，但阿托伐他汀是否可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活，發(fā)揮其抗腎纖維化作用目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究表明阿托伐他汀可以下調(diào)Wnt4蛋白的表達(dá)，從而減少或阻止了Wnt信號(hào)從胞外傳導(dǎo)至胞質(zhì)中，故GSK-3β不發(fā)生磷酸化，未磷酸化的GSK-3β對(duì)β-catenin蛋白有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin蛋白可被E-3泛素連接酶識(shí)別并被泛素化降解，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制下游致纖維化效應(yīng)靶基因的表達(dá)，延緩了UUO 腎臟EMT的發(fā)生和ECM的沉積，改善腎臟纖維化病變，阿托伐他汀抗UUO大鼠腎纖維化病變可能與其抑制Wnt4/β-catenin信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)有關(guān)。

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