康湘萍 陳 超 梁 超 戴薇薇 龔張斌 金國(guó)琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種來(lái)源于骨髓基質(zhì)中具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在一定的誘導(dǎo)條件下可分化為神經(jīng)外胚層細(xì)胞如少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞等〔1,2〕，其向神經(jīng)樣細(xì)胞分化潛能為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)疾病(如早老性癡呆、帕金森病、腦卒中等)提供了新的干細(xì)胞來(lái)源，具有非常重要的意義及研究?jī)r(jià)值〔3,4〕。然而B(niǎo)MSCs在骨髓中的含量非常少，占有核細(xì)胞總數(shù)的0.01%～0.1%。因此，培養(yǎng)、分離足夠數(shù)量、高純度的BMSCs可為后續(xù)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展提供必需的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在探討B(tài)MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的可行性，建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系，為BMSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，4周齡，體重(100±20)g，雄性，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK(滬)2013-0016〕。

1.2主要試劑和儀器 試劑：α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)于Gibco公司，β-巰基乙醇購(gòu)于Genview公司，CD90、CD29、CD34、CD45、神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)抗體及相關(guān)二抗均購(gòu)于Abcam公司，GAPDH抗體購(gòu)于CST公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自Pierce公司；儀器：臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，垂直式無(wú)菌無(wú)塵操作臺(tái)(造鑫企業(yè)有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，蛋白電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)ProteinSimple公司)。

1.3方法

1.3.1大鼠BMSCs的分離、原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)〔5〕將實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死，置于75%乙醇中浸泡15 min，在無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨、脛骨，剪掉兩端，用5 ml注射器吸取 α-MEM培養(yǎng)基5 ml反復(fù)沖洗骨髓腔3～5次，收集骨髓細(xì)胞懸液，吹打分散，1 000 r/min離心5 min棄上清，以10% FBS α-MEM培養(yǎng)基5 ml重懸細(xì)胞，混勻，移至6 cm培養(yǎng)皿中，置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)標(biāo)記為P0。48 h后首次更換培養(yǎng)基并去除非貼壁細(xì)胞，以后每隔3 d換液1次。當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)培養(yǎng)皿80%左右時(shí)用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA混合消化液消化，1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，標(biāo)記為P1，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，隔天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3.2大鼠BMSCs表面標(biāo)記物(CD90、CD29為的鑒定BMSCs表面抗原，CD34、CD45為造血干細(xì)胞表面抗原)的鑒定

1.3.2.1細(xì)胞免疫化學(xué)染色 取第3代(P3)細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)：棄原培養(yǎng)基，預(yù)熱的PBS洗細(xì)胞2次，加入200 μl預(yù)冷的甲醇室溫下固定5 min，室溫封閉30 min(10%山羊血清)，一抗室溫孵育1 h(避光，所有一抗的稀釋倍數(shù)均參考抗體說(shuō)明書(shū))，PBS洗細(xì)胞1次，加入熒光標(biāo)記二抗(1∶800倍稀釋)，室溫避光孵育1 h，PBS洗細(xì)胞3次后封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記情況。

1.3.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 細(xì)胞傳代至P3時(shí)消化收集細(xì)胞，1.2 ml 3%FBS/PBS重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml；各取100 μl細(xì)胞懸液，分別加入稀釋好的一抗(所有一抗的稀釋倍數(shù)均參考抗體說(shuō)明書(shū))，室溫避光孵育30 min；PBS洗細(xì)胞2次，1 200 r/min，離心3 min，預(yù)冷的3%FBS/PBS重懸細(xì)胞；加入熒光標(biāo)記二抗(稀釋倍數(shù)參考抗體說(shuō)明書(shū))，室溫避光孵育30 min；PBS洗細(xì)胞2次，1 200 r/min，離心5 min，500 μl預(yù)冷的3%FBS/PBS重懸細(xì)胞；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD29、CD34和CD45的表達(dá)情況。

1.3.3大鼠BMSCs的誘導(dǎo)分化及神經(jīng)標(biāo)志物檢測(cè)

1.3.3.1定向誘導(dǎo)分化〔6,7〕取第3代細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的12孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí)，應(yīng)用不同方法對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，以此分為3組(每組4孔細(xì)胞)：(1)空白對(duì)照組：10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基；(2)化學(xué)方法誘導(dǎo)組：誘導(dǎo)前培養(yǎng)板孔內(nèi)加入1 mmol/L的β-巰基乙醇預(yù)誘導(dǎo)24 h，更換無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基及5 mmol/L的β-巰基乙醇誘導(dǎo)6 h；(3)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組：給予含20 ng/ml bFGF的無(wú)血清α-12培養(yǎng)液誘導(dǎo)72 h。

1.3.3.2Western印跡檢測(cè)神經(jīng)標(biāo)志蛋白(Nestin,NSE,GFAP)的表達(dá) 加入RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，上樣量為40 μg蛋白/孔；電泳結(jié)束后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min；37℃，5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗4℃孵育過(guò)夜(所有一抗的稀釋比例均參照抗體說(shuō)明書(shū))。次日，0.1 mol/L PBST(pH7.4)洗膜后加入二抗(1∶10 000倍稀釋)，37℃孵育45 min；PBST洗膜后ECL顯色檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算積分密度值(IOD)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)5 d后貼壁細(xì)胞呈短梭形、多角形，散在分布，可見(jiàn)核仁；培養(yǎng)至13 d，細(xì)胞體狹長(zhǎng)，細(xì)胞相互融合，出現(xiàn)集落；傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，生長(zhǎng)均勻，呈紡錘形、漩渦狀分布，核仁清晰，折光性好。見(jiàn)圖1。

2.2BMSCs表面標(biāo)記物的鑒定 細(xì)胞免疫化學(xué)染色(圖2)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)(圖3)結(jié)果顯示：CD29、CD90表達(dá)陽(yáng)性(陽(yáng)性率分別為97.51%、96.85%)，CD34和CD45表達(dá)陰性(陽(yáng)性率分別為2.5%、3.8%)，故認(rèn)為體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。

A～C分別為原代細(xì)胞5、7、13 d，D為傳代細(xì)胞P2圖1 大鼠BMSCs形態(tài)圖(×100)

圖2 細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果(×200)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物

2.3誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)觀察 誘導(dǎo)前細(xì)胞大部分呈梭形，部分呈現(xiàn)橢圓形或圓形(圖4A)；β-巰基乙醇誘導(dǎo)2 h后，胞體收縮，折光性增強(qiáng)，個(gè)別細(xì)胞伸出突起，6 h后出現(xiàn)較典型的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)改變，呈雙極或多極，部分突起連成網(wǎng)狀(圖4B)；bFGF誘導(dǎo)24 h后，部分細(xì)胞胞體收縮成錐形，折光性增強(qiáng)，72 h后細(xì)胞可見(jiàn)明顯突起，細(xì)長(zhǎng)呈樹(shù)枝狀，并交織成網(wǎng)狀，為典型的神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)改變，呈雙極或多極(圖4C)。

2.4Western印跡檢測(cè)神經(jīng)標(biāo)志蛋白(Nestin,NSE,GFAP)的表達(dá) Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物，NSE是神經(jīng)元標(biāo)志物，GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，β-巰基乙醇及bFGF誘導(dǎo)后，Nestin、NSE及GFAP蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，兩誘導(dǎo)組之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明在上述誘導(dǎo)劑的作用下，BMSCs可向神經(jīng)樣細(xì)胞定向分化，且分化細(xì)胞主要為神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞，見(jiàn)圖5，圖6。

A.空白對(duì)照組；B.β-巰基乙醇誘導(dǎo)分化6 h后；C.bFGF誘導(dǎo)分化72 h后圖4 誘導(dǎo)BMSCs分化前后細(xì)胞形態(tài)圖(×200)

A.空白對(duì)照組；B.化學(xué)方法誘導(dǎo)組；C.生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組圖5 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志蛋白(Nestin,NSE,GFAP)表達(dá)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05圖6 各組神經(jīng)標(biāo)志蛋白表達(dá)水平

3 討 論

神經(jīng)細(xì)胞起源于外胚層，傳統(tǒng)認(rèn)為成體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目恒定不可再生，現(xiàn)在的研究也表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自身修復(fù)能力非常有限，其損傷與再生一直是困擾醫(yī)學(xué)的難題。BMSCs是一種來(lái)源于中胚層但卻可以向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層分化，具有強(qiáng)大的自我更新能力及多向分化潛能，在特定條件下可誘導(dǎo)分化為多個(gè)細(xì)胞系，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等〔8〕。由于BMSCs來(lái)源于骨髓，具有取材容易，易于分離、培養(yǎng)，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可在體外擴(kuò)增，無(wú)倫理問(wèn)題等特點(diǎn)；因此可作為理想的種子細(xì)胞或載體細(xì)胞用于細(xì)胞移植、基因治療和細(xì)胞治療等方面。

但是BMSCs在骨髓中的含量非常少，而體外實(shí)驗(yàn)及臨床治療一般需要大量高純度的BMSCs，必須依賴于BMSCs的體外擴(kuò)增。目前，比較公認(rèn)的分離培養(yǎng)BMSCs的方法主要有4種：全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法及免疫磁珠分選法。其中，全骨髓貼壁培養(yǎng)法是獲得BMSCs最為簡(jiǎn)單的方法，可以很好地保護(hù)細(xì)胞的活力，經(jīng)過(guò)換液、傳代可去除大量雜細(xì)胞，獲得高純度、并具備分化潛能的BMSCs。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法進(jìn)行大鼠BMSCs的分離、純化，培養(yǎng)至第3代時(shí)應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)和鑒定，結(jié)果提示分離培養(yǎng)的為純度較高的BMSCs，且增殖能力比較穩(wěn)定、適于誘導(dǎo)分化，可選取第3代BMSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

研究表明，骨髓中的細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，在腦組織受損傷后尤為明顯〔9〕，因此BMSCs是治療腦外傷、腦梗死、帕金森病及老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞〔10～12〕。趙慧新等〔13〕通過(guò)移植腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)轉(zhuǎn)染的BMSCs治療AD大鼠，發(fā)現(xiàn)其對(duì)AD大鼠的認(rèn)知有改善作用，且能促進(jìn)海馬區(qū)N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)1的表達(dá)。目前，體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的方法主要有3種〔14〕：化學(xué)誘導(dǎo)、生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)及抗氧化劑誘導(dǎo)。因誘導(dǎo)后的細(xì)胞從形態(tài)上看類似于神經(jīng)細(xì)胞，故多稱之為“神經(jīng)元樣細(xì)胞”或“神經(jīng)樣細(xì)胞”。其中化學(xué)誘導(dǎo)包括β-巰基乙醇、硫代甘油、維甲酸(RA)等〔15,16〕；生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)如bFGF、BDNF等〔17〕；抗氧化劑誘導(dǎo)如中藥及其有效成分、褪黑素等。本研究分別采用β-巰基乙醇及bFGF誘導(dǎo)BMSCs定向分化，結(jié)果表明，在上述誘導(dǎo)劑的作用下，BMSCs可進(jìn)行分化，且分化細(xì)胞具備神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)及特征。

本研究成功建立BMSCs的體外培養(yǎng)體系，并可在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，為BMSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與依據(jù)；但是誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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