孫新六

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實驗室，山東 泰安 271000)

Kisspeptin對早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

孫新六

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實驗室，山東 泰安 271000)

目的 探討黑色素轉(zhuǎn)移抑制基因(Kisspeptin，KP)基因在早期胚胎中對滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞KP和KP受體GPR54表達，實時定量RT-PCR檢測Kisspeptin基因表達，SDS-PAGE和western-blot檢測 Kisspeptin蛋白表達，細(xì)胞劃痕實驗檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲性。結(jié)果 90%以上培養(yǎng)的細(xì)胞均表達KP和其受體GPR54；KP抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移率為44.1%，KP抑制MMP-9和VEGF表達。結(jié)論 KP抑制早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移，抑制ERK和血管活化相關(guān)因子。

黑色素轉(zhuǎn)移抑制基因；滋養(yǎng)層細(xì)胞；早期胎盤

胎盤形成中絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮壁不斷侵蝕，侵入母體子宮內(nèi)壁蛻膜和子宮肌層,改造子宮壁螺旋動脈,形成豐富血管通道，使母體和胎兒之間具有足夠的營養(yǎng)和氣體交換[1]，此過程的失調(diào)可導(dǎo)致多種孕期并發(fā)癥，滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵貧乏可導(dǎo)致子癇前期癥狀和胎兒宮內(nèi)生長受限,過度入侵則導(dǎo)致胎盤異常增生[2]。本研究旨在探討黑色素轉(zhuǎn)移抑制基因(Kisspeptin，KP)調(diào)節(jié)早期胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲行為中的作用。

1 材料和方法

1.1試劑和抗體

鼠源抗人GPR54抗體,鼠源抗人Kisspeptin抗體，鼠源抗人β-actin抗體，均購于BOSTER公司。Kisspeptin抑制劑P234購于美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1組織收集 胎盤來自患者自愿終止妊娠，均為3個月內(nèi)早期胎盤?；颊呔橥?，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。取下胎盤后立即無菌狀態(tài)下剪取胎盤絨毛膜組織,用預(yù)先冰冷的PBS液漂洗3遍，分離滋養(yǎng)層細(xì)胞進行培養(yǎng)。

1.2.2滋養(yǎng)層細(xì)胞分離和培養(yǎng) 無菌操作，胎盤組織以眼科鑷子剪成碎塊,在含有0.25%胰蛋白酶和DNA酶(200 U/ml)溶液中37℃消化3次，每次30 min，收集懸浮細(xì)胞，棄去組織塊，PBS液漂洗2次，以Percoll液梯度離心(3000 r/min，20 min)分離細(xì)胞。收集的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中用RPMI 1640液培養(yǎng)1 h使巨噬細(xì)胞貼壁吸附去除，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)于24孔板中，用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，隔天半量換液。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)分析 滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)于放有蓋玻片的6孔板中，爬滿細(xì)胞后，棄培養(yǎng)液并以PBS液輕輕漂洗。取出覆有細(xì)胞的玻片，細(xì)胞固定后，以甲醇處理10 min，滅活細(xì)胞內(nèi)過氧化酶，分別加入標(biāo)記的鼠抗人cytokeratin-7(1∶50稀釋)和抗GPR54(1∶50稀釋)一抗，37 ℃作用1 h，PBS液漂洗后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗作用1 h,最后加入底物DAB液顯色。同時以DAPI染液將滋養(yǎng)層細(xì)胞染成藍色。

1.2.4Kisspetin及GPR54 mRNA檢測 總RNA采用TriZol液常規(guī)提取，首先RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:42 ℃,30 min逆轉(zhuǎn)錄，95 ℃，1 min滅活轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)產(chǎn)物進行熒光定量PCR。Kisspetin基因上游引物P1：5’-CTCACTGGTTTCTTGGCAGCTAC-3’,下游引物P2：5’-AGAGCCTACCCAGATGCTGAG-3’；GPR54基因上游引物：5’-GCTGGTACGTGAC GGTGTTC-3’，GPR54基因下游引物：5’-AGAGCCTACCCAGATGCTGAG-3’。MMP-9基因上游引物:P1：5’-TGGAGGTTCGACGTGAAGG-3’，下游引物P2：5’-AAATAGGCTTTC TCTCGGTACTGG-3’；VEGF基因上游引物：5’- ACATCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3’,下游引物P2:5’-TGGCCGTTGAGGTTGGAATG-3’。反應(yīng)條件(40個循環(huán))：95℃，15 s變性; 60℃,40 s復(fù)性和延伸，內(nèi)參基因β-actin同時擴增。以2-△△T法檢測Kisspetin基因相對于內(nèi)參基因表達率。

1.2.5蛋白質(zhì)提取和SDS-PAGE 滋養(yǎng)層細(xì)胞離心漂洗收集后，用蛋白提取試劑盒進行蛋白質(zhì)提取。BCA法測量樣品蛋白濃度：標(biāo)準(zhǔn)品系列梯度濃度稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各加入200 μl BCA工作液，37 ℃靜置30 min,酶標(biāo)儀以A562 nm測定樣品蛋白含量。取100 μl蛋白液混合等體積樣品上樣液，以120 V電壓進行SDS-PAGE電泳1.5 h。

1.2.6免疫印跡 SDS-PAGE電泳分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，PVDF膜在封閉液(5%脫脂奶粉,0.5% Tween-20)中輕搖1 h，加入鼠源抗GPR54抗體 (1∶500稀釋),鼠源抗Kisspeptin (1∶500稀釋),4 ℃過夜,漂洗后加入 HRP標(biāo)記的二抗( 1∶5000稀釋)作用1h,加入化學(xué)發(fā)光底物，在UVP成像系統(tǒng)以Dynamic Integration模式拍照分析。

1.2.7細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)檢測 滋養(yǎng)層細(xì)胞分為3組培養(yǎng)。對照組：培養(yǎng)液不加KP和抑制劑；KP組：培養(yǎng)液加KP蛋白，終濃度為100 nM;KP+P234組：培養(yǎng)液加KP和抑制劑，終濃度為100 nM。各組培養(yǎng)液與滋養(yǎng)層細(xì)胞共同孵育30 min后，收集滋養(yǎng)細(xì)胞，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，wersten-blot檢測ERK和磷酸化ERK(P-EKR),求出其比值。

1.2.8細(xì)胞劃痕實驗 滋養(yǎng)層細(xì)胞分3組培養(yǎng)(分組方法同1.2.7)。滋養(yǎng)層細(xì)胞在6孔板中生長融合后，以吸頭輕輕劃痕，以無菌PBS液輕柔沖去劃痕中散落的細(xì)胞，細(xì)胞在37 ℃和5%的二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)48 h。在顯微鏡下分別測量在0 h和48 h劃痕的寬度，遷移率是48 h時劃痕兩邊緣距離減小值與0 h劃痕兩邊緣距離比值，沒有加KP和KP抑制劑P234的對照組遷移率被認(rèn)為是1。

1．3統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計分析,兩組數(shù)據(jù)以t檢驗方法，多組以ANOVA方法統(tǒng)計分析組間實驗數(shù)據(jù)差異顯著性。以P≤0.05為統(tǒng)計學(xué)有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1滋養(yǎng)層細(xì)胞KP和GPR54表達

培養(yǎng)的細(xì)胞首先進行抗細(xì)胞角蛋白(cytokeratin-7)染色以確定滋養(yǎng)層細(xì)胞比例，再進行KP受體GPR54染色。染色結(jié)果顯示，cytokeratin-7陽性細(xì)胞比例為(92.2±5.4)%, 幾乎所有的細(xì)胞都表達GPR54。染色結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞大約90%同時表達cytokeratin-7 和GPR54(圖1)，表明分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞純度符合研究要求。

圖1 滋養(yǎng)層細(xì)胞免疫染色 (×400)

2.2早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞GPR54和KP mRNA表達

以熒光定量PCR法檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞KP-54和其受體GPR 54相對表達,早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均表達GPR54和KP mRNA，SDS-PAGE和Western-blot顯示滋養(yǎng)層細(xì)胞表達GPR54和KP蛋白(圖2)。

圖2 滋養(yǎng)層細(xì)胞KP-54和GPR54蛋白表達

2.3細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)在滋養(yǎng)層細(xì)胞表達

KP蛋白與滋養(yǎng)層細(xì)胞共同孵育30 min, 磷酸化的P-ERK與未磷酸化的ERK比值相對于對照組(不加KP和抑制劑P234)增加(2.3±0.5)倍，KP和KP的抑制劑P234與滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，P-ERK/ERK相對增加(1.6±0.3)倍。三組實驗數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA統(tǒng)計分析差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗顯示滋養(yǎng)層細(xì)胞與KP和 KP拮抗劑共培養(yǎng),抑制了KP誘導(dǎo)的ERK磷酸化作用。

圖3 早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞 P-ERK和ERK表達

2.4KP抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移

以細(xì)胞劃痕-遷移(scratch-migration)實驗評估KP對早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移的影響。相對于未經(jīng)處理的細(xì)胞，KP治療滋養(yǎng)層細(xì)胞48 h后抑制細(xì)胞遷移率44.1%。滋養(yǎng)層細(xì)胞和KP、P234共培養(yǎng)阻遏了KP介導(dǎo)的對早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移抑制作用,相對抑制細(xì)胞遷移率減為18.2%。具體數(shù)據(jù)見表1。此實驗表明KP抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移，此作用能被KP的拮抗劑P234所抑制。

表1 滋養(yǎng)層細(xì)胞劃痕遷移(μm)

2.5KP對MMP-9和VEGF表達的影響

熒光定量PCR檢測在KP和抑制劑P234作用下MMP-9和VEGF表達變化(表2)。滋養(yǎng)層細(xì)胞在KP作用下降低了MMP-9和VEGF的表達，空白對照組表達率設(shè)為1，則MMP-9和VEGF表達率分別為0.362±0.102、0.482±0.126。加入抑制劑P234后，KP降低效應(yīng)減少，兩者表達率分別為0.624±0.153和0.846±0.172。以ANOVA方法統(tǒng)計分析，三組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 滋養(yǎng)層細(xì)胞相對遷移率

因子對照組KPKP+P234MMP?910362±01020624±0153VEGF10482±01260846±0172

3 討 論

絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)壁入侵過程與腫瘤轉(zhuǎn)移相似[2],兩者具有相似的分子機制進行遷移和入侵。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)至關(guān)重要。MMP-9在滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵中發(fā)揮重要作用[3],，基質(zhì)金屬蛋白酶的活性又受到組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)影響。Kisspeptin(KP)是由KiSS-1基因(黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制基因)編碼的肽類激素,其受體是G蛋白耦聯(lián)受體GPR54，具有影響癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)生殖功能和影響內(nèi)分泌等作用。人KiSS-1基因定位于1q32區(qū), 其基因結(jié)構(gòu)包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。KISS1基因編碼145個氨基酸，不同剪接形成長短不一的KP多肽，KP可調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)的分泌[4]。KP結(jié)合G蛋白受體GPR54,可激活磷脂酶C，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加。KP能夠激活細(xì)胞中的ERK信號通路，使細(xì)胞永生化[5]。Ohtaki等人從人胎盤分離了由KiSS-1基因編碼的Kisspeptin。KP和GPR54最初均表達于受精卵合胞體細(xì)胞，Kisspeptin與胎盤的形成有關(guān)，在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Kisspeptin和GPR54表達，Kisspeptin的轉(zhuǎn)錄表達在早期和末期胎盤無變化, 但GPR54的表達在早期的胎盤高于末期胎盤, 這與懷孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞高侵入性而末期胎盤低侵入性相一致。我們采用妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過KP共培養(yǎng)效果來研究滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達變化。

實驗表明早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均表達GPR54和KP， KP抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力。KP能刺激ERK磷酸化,KP共培養(yǎng)可以抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的入侵能力，KP通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達控制滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)壁侵襲力。免疫印跡顯示KP蛋白可激活滋養(yǎng)層細(xì)胞中ERK,加入KP抑制劑P234則減弱了此抑制作用。KP作用機制是KP與其受體GPR54結(jié)合后,可激活磷脂酶C (PLC),使二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解,產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇 (IP3)和甘油二脂(DAG),從而使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK),從而產(chǎn)生生物學(xué)作用?；|(zhì)金屬蛋白酶能降解細(xì)胞外基底膜，在組織形態(tài)發(fā)生中扮演重要角色?；|(zhì)金屬蛋白酶在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞對螺旋動脈的入侵和改造過程中起重要作用[6]，MMP-9表達減少時，滋養(yǎng)層細(xì)胞顯示低弱入侵能力，易誘發(fā)子癇前期癥狀及胎兒宮內(nèi)生長受限[7]。KP可控制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9活性，KP通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生抑制作用，此作用受到TIMP1抑制。滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵子宮內(nèi)膜，通過替換血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)壁血管。實驗表明KP下調(diào)了VEGF表達，KP通過控制VEGF表達調(diào)控血管生成。滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵子宮內(nèi)壁受到多種細(xì)胞因子監(jiān)控，TGF-β1通過刺激TIMP表達限制滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵[8]，TNFα則激活蛻膜巨噬細(xì)胞,限制妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞的入侵[9]。細(xì)胞因子正向和負(fù)向調(diào)控使滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)壁適當(dāng)入侵。

我們研究結(jié)果表明,KP抑制早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和移動。KP抑制MMP-9轉(zhuǎn)錄及促使VEGF轉(zhuǎn)錄。為進一步研究孕早期以KP體內(nèi)調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵胎盤提供了依據(jù)。

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Regulating effect of Kisspeptin on trophoblast cells of early placenta

SUN Xin-liu

(Taian Central Hospital, Taian 271000，China)

Objective: To investigate the role of Kisspeptin gene in the regulation of trophoblast cells of early placenta. Methods: The expression of Kisspeptin and GPR54 were detected with immunocytochemistry, Kisspeptin gene expression by real-time quantitative RT-PCR, the expression of Kisspeptin protein with SDS-PAGE and western-blot, and cell scratch assay was made on invasion of trophoblast cells. Results: KP and GPR54 was expressed in 90% cells cultured; KP inhibited the migration of trophoblast cells, Kisspeptin inhibited the expression of MMP-9 and VEGF. Conclusion: KP inhibits cell migration of early placental trophoblast cells, and ERK and vasoactivation related factors.

Kisspeptin;trophoblast cell;early embryo

孫新六(1970—)，男，安徽安慶人，碩士，主要從事臨床分子生物學(xué)研究工作。

R737.9

A

1004-7115(2018)01-0010-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2018.01.003

2017-11-16)