李 磊 孫衍福 李 帥 王慶才

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院消化內(nèi)一科，山東 泰安 271000； 2. 泰安市中心醫(yī)院分院，山東 泰安 271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬萊蕪醫(yī)院，山東 萊蕪 271100)

氧化苦參堿對胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖的影響

李 磊1孫衍福2李 帥3王慶才1

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院消化內(nèi)一科，山東 泰安 271000； 2. 泰安市中心醫(yī)院分院，山東 泰安 271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬萊蕪醫(yī)院，山東 萊蕪 271100)

目的 觀察氧化苦參堿(OM)對人胃癌SGC-7901細(xì)胞中P21表達(dá)的影響，研究其抑制細(xì)胞增殖的途徑。方法 首先在體外進(jìn)行胃癌細(xì)胞SGC-7901的培養(yǎng)， 采用流式細(xì)胞儀觀察不同濃度(2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml )[1]的氧化苦參堿在24 h和36 h不同時間下對SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖的抑制效果，然后通過Western blot方法觀察SGC-7901胃癌細(xì)胞內(nèi)P21基因表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，不同濃度(2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml)OM可使細(xì)胞阻滯于G0/G1期[24 h:(67.5±0.1)%,(69.5±1.4)%,(71.0±1.0)% vs. (58.6±0.4)%,P<0.0 5; 36 h：(68.5±0.3)%,(71.9±0.9)%,(78.0±0.4)% vs. (58.8±0.1)%,P<0.05)]，上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子P21蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論 OM可能通過阻滯細(xì)胞DNA合成，使胃癌細(xì)胞處于G0/G1期，并且可以上調(diào)P21的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗腫瘤增殖作用。

氧化苦參堿；胃癌；P21；細(xì)胞周期；流式細(xì)胞術(shù)

氧化苦參堿(Oxymatrine,OM)是從中藥苦參中提取的一種具有抗病毒和抗纖維化作用的生物堿，能夠在患者放化療后顯著提升白細(xì)胞水平。近來研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿對腫瘤細(xì)胞有著較好的殺傷效果，同時能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性，因而目前也廣泛應(yīng)用于臨床輔助抗癌藥物治療之中[2]。本實(shí)驗(yàn)通過研究氧化苦參堿對于胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖的影響，了解其抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由深圳市白恩維生物科技有限公司提供；氧化苦參堿購自山東華明藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：011230，規(guī)格：2 ml/*200 mg。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與增殖

1.2.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901從液氮中取出，放置在37 ℃的恒溫水浴箱中搖動1～2 min解凍，離心5 min后將上清液倒掉，加入含有10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液。在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液。瓶底的細(xì)胞數(shù)量面積在80%以上時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)36 h左右時，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，采用1000 r/min離心，10 min后收集細(xì)胞，并利用新的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，對細(xì)胞計數(shù)之后按照每孔1×106的個數(shù)分別接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再次將其在同樣的環(huán)境中培養(yǎng)1夜后，讓細(xì)胞貼壁備用。

1.2.1.2與氧化苦參堿共孵育 實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組(A1、A2)和實(shí)驗(yàn)組(B1、B2、B3、B4、B5、B6)，當(dāng)細(xì)胞貼壁后于實(shí)驗(yàn)組加入氧化苦參堿溶液，使其終濃度分別為2 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、4 mg/ml，補(bǔ)足體積為220 μl，混勻后放入CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h和36 h，收集細(xì)胞和上清液。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)分析

①利用冷PBS對藥物處理的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，收集細(xì)胞；②準(zhǔn)備結(jié)合緩沖液，并加入雙蒸水進(jìn)行稀釋；③取PI工作液加入到結(jié)合緩沖液之中，儲備待用；④收集細(xì)胞，去除上清液后將細(xì)胞的濃度調(diào)整為1×106/L；⑤將PI工作液加入到細(xì)胞懸濁液中，在室溫條件下孵育15 min；⑥加入結(jié)合緩沖液并輕輕搖勻，把實(shí)驗(yàn)用的樣本放在冰上面；⑦流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞DNA含量。

1.2.3Western blot試驗(yàn)

1.2.3.1細(xì)胞蛋白提取 收集不同濃度藥物作用的SGC-7901細(xì)胞，PBS洗3次之后，將PBS吸收干凈，冰上反應(yīng)30 min將細(xì)胞刮凈，40 ℃ 12000 r/min離心待測蛋白濃度。在培養(yǎng)皿加入200 μl RIPA裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，期間多次輕搖培養(yǎng)皿，使其裂解完全，冰上吸上清分裝，置于冰箱保存。

1.2.3.2蛋白質(zhì)濃度測定 將離心待測蛋白加入PBS稀釋為濃度5 mg/ml，-20 ℃保存。根據(jù)樣品的數(shù)量來配置適量的BCA工作液，工作液的配置比例為BCA試劑A∶B為50∶1的體積比。分別按照0，1，2，4，8，12，16，20 μl體積的BSA加入到96孔板之中，并用PBS將其分別補(bǔ)足到20 μl。取適當(dāng)體積的待測樣品放置在96孔板之內(nèi)，同樣用PBS將其補(bǔ)足到20 μl，每個樣品保持3個平行孔，適當(dāng)調(diào)整樣品濃度使其OD值能夠滿足在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。每個孔內(nèi)都分別加入BCA工作液，37 ℃放置30 min。利用酶標(biāo)儀562 nm測定OD值，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各個樣品蛋白濃度值。最后完成變性及電泳。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示實(shí)驗(yàn)用的數(shù)據(jù)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，同時用Quantity One軟件分析Western blot，若P≤0.05，則說明具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1OM使細(xì)胞堆積于G0/G1期

氧化苦參堿處理SGC-7901人胃癌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞在G0/G1期所占的百分比提高，而S期和G2/M期的細(xì)胞百分比下降，具體如表1所示。

氧化苦參堿處理24 h后，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)方差分析與均數(shù)兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，不同濃度的氧化苦參堿對于胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用。G0/G1期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果分別為：t=1.478,P=0.033；t=1.698,P=0.023；t=1.329,P=0.035；S期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為：t=5.41,P=0.025；t=4.67,P=0.032；t=3.25,P=0.02；G2/M期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為：t=1.35,P=0.03；t=1.59,P=0.04；t=2.58,P=0.01，P均<0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。且根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析顯示：OM作用24 h后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期分布2 mg/ml與3 mg/ml比較結(jié)果：t=2.45,P=0.035；t=3.52,P=0.024；t=1.25,P=0.041，OM作用24 h后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期分布3 mg/ml與4 mg/ml比較結(jié)果t=2.53,P=0.015；t=5.22,P=0.034；t=2.58,P=0.022。其中P值均小于0.05，提示伴隨氧化苦參堿濃度的增加，使胃癌SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G0/G1期的效果越明顯。

表1 OM作用24h后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

氧化苦參堿處理36 h后，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)方差分析與均數(shù)兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較，不同濃度的氧化苦參堿對于胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用。G0/G1期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比t檢驗(yàn)結(jié)果分別為：t=2.63,P=0.024；t=2.33,P=0.014；t=3.12,P=0.012；S期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為：t=1.32，P=0.033；t=5.41，P=0.024；t=3.21,P=0.036；G2/M期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為t=6.25,P=0.017；t=3.24,P=0.048；t=3.78,P=0.029)，P<0.05,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。且根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析顯示：OM作用36 h后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期分布2 mg/ml與3 mg/ml比較結(jié)果：t=4.89,P=0.017；t=7.14,P=0.024；t=6.21,P=0.087，OM作用36 h后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期分布3 mg/ml與4 mg/ml比較結(jié)果t=4.21，P=0.019；t=2.14，P=0.022；t=3.78,P=0.048。其中P值均小于0.05，因此提示：伴隨氧化苦參堿濃度的增加，使胃癌SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G0/G1期的效果越明顯。具體數(shù)據(jù)見表2，圖1。

表2 OM作用36h后SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

2.2氧化苦參堿對細(xì)胞周期蛋白的影響

通過Western blot法來檢測P21蛋白水平，來進(jìn)一步驗(yàn)證OM對蛋白表達(dá)的影響。OM能夠使細(xì)胞阻滯在G0/G1期,Western blot法檢測周期蛋白結(jié)果顯示，不同濃度的OM作用于胃癌細(xì)胞后P21的蛋白含量不同，表明細(xì)胞發(fā)生了周期阻滯。此外在36 h時P21蛋白含量增加最為明顯(P<0.05)，見圖2。

對Western blot檢測法來檢測P21蛋白水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，24 h時2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組進(jìn)行方差分析與均數(shù)兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果分別為：t=5.24,P=0.042；t=7.38,P=0.018；t=1.69,P=0.032；36 h時2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組進(jìn)行t檢驗(yàn)結(jié)果分別為：t=5.32，P=0.014；t=3.54,P=0.021；t=2.45,P=0.034；P值均小于0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即不同濃度的氧化苦參堿對于胃癌細(xì)胞中P21蛋白的表達(dá)具有明顯的影響。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示24 h時2 mg/ml、3 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達(dá)情況比較結(jié)果分別為：t=5.73,P=0.006；3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達(dá)情況比較結(jié)果分別為：t=4.77,P=0.036；36 h時2 mg/ml、3 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達(dá)情況比較結(jié)果分別為：t=5.68,P=0.007；3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達(dá)情況比較結(jié)果分別為：t=6.72,P=0.023；伴隨濃度的增加，胃癌細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)水平越高，且不同濃度作用下24 h和36 h的胃癌細(xì)胞中P21蛋白進(jìn)行t檢驗(yàn)分析(t=4.27,P=0.008；t=3.68,P=0.026；t=5.78,P=0.047)P<0.05，結(jié)果具統(tǒng)計學(xué)意義，故不同時間下，氧化苦參堿對于胃癌細(xì)胞P21蛋白的表達(dá)水平影響不同，伴隨時間的增加氧化苦參堿作用下的P21蛋白表達(dá)水平越高。具體如表3。

表3 氧化苦參堿作用下P21蛋白的表達(dá)水平

圖1 氧化苦參堿對SGC-7901細(xì)胞作用36 h后DNA合成的抑制作用

圖2 氧化苦參堿對SGC-7901細(xì)胞作用36 h后P21蛋白水平

3 討 論

胃癌目前是全世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，我國則同樣是胃癌發(fā)病率及病死率最高的國家之一，分別為42%和35%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出世界的平均水平[3]。近年來，胃癌已經(jīng)逐漸呈現(xiàn)出了年輕化的趨勢，目前19～35歲的胃癌年輕患者比例已經(jīng)上升到了3.3%。為了確保人們的健康，減少胃癌死亡率，迫切需要對胃癌發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行研究，從而尋求抗胃癌藥物的新靶點(diǎn)。通過已有的研究發(fā)現(xiàn)，OM可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡，同時能夠提升白細(xì)胞，增加免疫活性T細(xì)胞，綜合提升機(jī)體的免疫力[4]。

此次研究利用流式細(xì)胞儀來進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測，從細(xì)胞生長增殖的角度來分析OM對其的抑制作用。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過OM的作用，SCG-7901細(xì)胞在G0/G1期的比例增加，S期細(xì)胞的比例減少。表明OM對于胃癌細(xì)胞的作用主要體現(xiàn)在阻止其G1/S期的生長，抑制其增殖。從分子生物的研究角度來看，細(xì)胞的生命周期包含了G0、G1期、S期、G2期和M期，其中，S期是DNA的合成期,G1期是合成前期，G2期是合成后期。從最初的靜止?fàn)顟B(tài)G0期開始，細(xì)胞通過胞質(zhì)分離和增殖進(jìn)入到G1期，隨后進(jìn)入到S期進(jìn)行DNA的復(fù)制[5]。細(xì)胞染色體復(fù)制正確后，則會進(jìn)入到M期的有絲分裂的準(zhǔn)備期G2期，細(xì)胞在M期會產(chǎn)生2個穩(wěn)定遺傳的子細(xì)胞。當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)程序的紊亂，就會出現(xiàn)人體疾病的發(fā)生，包括了癌癥的發(fā)生[6]。細(xì)胞生命周期中最為關(guān)鍵的就是DNA的合成期和細(xì)胞分裂期[7]。細(xì)胞周期的停滯，指的是細(xì)胞在受到不利因素的影響時主動停止在某個階段，從而消除所受到的不利影響[8]。近年來的研究中，使惡性腫瘤細(xì)胞周期停滯成為一種新的治療方式的嘗試，高等真核細(xì)胞之中，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期活動主要依靠于細(xì)胞的周期蛋白，細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期分別依賴性激酶CDK和CDI共同作用完成對細(xì)胞周期的調(diào)控[9]。因而，周期蛋白的異常表達(dá)，就會和腫瘤的臨床分期、預(yù)后、治療等有著密切的聯(lián)系[10]。

本次實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞技術(shù)和Western bolt方法研究氧化苦參堿對人胃癌SGC-7901細(xì)胞P21的影響，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿能夠上調(diào)P21的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，檢測到細(xì)胞周期停滯及凋亡。研究結(jié)果顯示隨著氧化苦參堿作用時間和劑量的增加，對SGC-7901的抑制作用效果越明顯。這是由于氧化苦參堿對細(xì)胞凋亡起到誘導(dǎo)作用的同時也會使端粒酶活性下調(diào)，且氧化苦參堿濃度越大、作用時間越長，對腫瘤細(xì)胞所表現(xiàn)的抑制作用也越明顯[11]。提示氧化苦參堿通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞P21基因表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對其生長的影響，這也為腫瘤治療的藥物靶點(diǎn)研究提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)[12]。

氧化苦參堿對腫瘤細(xì)胞增殖起抑制作用，是通過阻滯于G0/G1期，上調(diào)P21阻滯DNA合成。腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的降低和OM對細(xì)胞P21轉(zhuǎn)錄抑制有一定的關(guān)系，隨著OM藥物劑量的增加，P21表達(dá)也會呈現(xiàn)出逐漸上調(diào)的趨勢。對該現(xiàn)象的產(chǎn)生可以理解為氧化苦參堿對SGC-7901細(xì)胞P21表達(dá)是從對轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)開始，進(jìn)而會在后期出現(xiàn)量的增加及促進(jìn)。但對于OM對P21的促進(jìn)是否存在著MAPK通路、ras基因及通路、trans well等方面的影響，則還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究來探明。

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Effects of Oxymatrine on the expression of P21 in human gastric cancer cell line SGC-7901

LI Lei1SUN Yan-fu2LI Shuai3WANGQing-cai1

(1.Dept. of Gastroenterology, Taian City Central Hospital,Taian 271000,China;2.Taian Central Hospital branch Hospital, Taian 271000,China; 3.Laiwu People's Hospital,Laiwu 271100,China)

Objective:To investigate the effects of Oxymatrine (OM) on the expression of P21 in human gastric cancer cell line SGC-7901 and the mechanism of inhibiting the proliferation of human gastric cancer cells. Methods:Gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured in vitro. Flow cytometry was used to observ.e the inhibitory effects of Oxymatrine(2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml) on the proliferation of SGC-7901 gastric cancer cells at different time of 24h and 36h. The expression of P21 gene in gastric cancer cell line SGC-7901 was observed by Western blot methods. Results: Compared with the control group, different concentration (2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml) OM to cell cycle arrest in G1/G0 phase [24 h:(67.5±0.1)%,(69.5±1.4)%,(71.0±1.0)% vs. (58.6±0.4)%,P<0.0 5; 36 h：(68.5±0.3)%,(71.9±0.9)%,(78.0±0.4)% vs. (58.8±0.1)%,P<0.05)], the expression level of up regulation of cell cycle negative regulatory factor P21 (P<0.05). Conclusion: OM may play a novel role in anti-tumor effect by blocking the cell DNA synthesis, and can up regulate the expression of P21 in G1/G0 phase of in gastric cancer cells.

Oxymatrine;gastric cancer;P21;cell cycle;flow cytometry.

李磊(1979—)，男，山東泰安人，副主任醫(yī)師，博士，主要從事消化系統(tǒng)基礎(chǔ)和臨床研究。

R735.2

A

1004-7115(2018)01-0006-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2018.01.002

2017-11-05)