張金宇 秦玉璘 張璐璐 王曉娟 姜遠(yuǎn)英 韓冰 曹永兵

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué) 新藥研究中心，上海 200433；2.上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院,上海 201100)

白念珠菌中的自噬研究進(jìn)展

張金宇1秦玉璘2張璐璐1王曉娟2姜遠(yuǎn)英1韓冰2曹永兵1

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué) 新藥研究中心，上海 200433；2.上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院,上海 201100)

自噬影響著真核細(xì)胞的適應(yīng)性、分化和發(fā)育，在白念珠菌中自噬影響著白念珠菌的代謝和毒力等，也可以減緩應(yīng)激反應(yīng)帶來的損傷，增強(qiáng)菌體存活能力。但過度的自噬可能導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡。該文根據(jù)近期研究進(jìn)展，從白念珠菌中與自噬相關(guān)的Cvt (Cytoplasm to vacuole trafficking pathway)通路、TOR (target of rapamycin)通路和自噬在應(yīng)激中的作用等幾個方面，對白念珠菌中的自噬進(jìn)行綜述。

白念珠菌；自噬；Cvt通路；TOR通路；應(yīng)激刺激；氮饑餓

等重要現(xiàn)象的一個新途徑。白念珠菌中自噬的相關(guān)分子機(jī)制研究較少，故本文從近期研究中，對白念珠菌中的自噬發(fā)生相關(guān)基因和調(diào)節(jié)自噬的可能通路以及自噬在應(yīng)激等條件下的作用進(jìn)行綜述。

1 白念珠菌中Cvt通路與自噬

1.1 Cvt通路與自噬

自噬的發(fā)生和Cvt通路可能有相似的機(jī)制。在饑餓狀態(tài)或者不利生長的應(yīng)激條件下，胞質(zhì)被包裹起來并運(yùn)向液泡 (Cvt通路)內(nèi)進(jìn)行降解。近期研究發(fā)現(xiàn)，在氮饑餓的環(huán)境中，抑制液泡V-ATPase酶活性，酵母細(xì)胞則不能發(fā)生自噬[10]。當(dāng)菌體自噬缺陷時Cvt通路也缺陷，已有實驗將Cvt通路發(fā)生標(biāo)志性蛋白ApeI與綠色熒光蛋白 (GFP)連接，在顯微鏡下觀察到，在自噬缺陷菌體中綠色熒光蛋白在液泡邊緣，并不能進(jìn)入液泡，即自噬缺陷，Cvt通路亦缺陷[11-12]。酵母細(xì)胞中Cvt通路蛋白API (aminopeptidase I)前體在胞質(zhì)中合成，然后被募集組成結(jié)構(gòu)高度有序的Cvt復(fù)合物[13]，在誘導(dǎo)自噬的饑餓條件下，API前體通過自噬小體進(jìn)入液泡內(nèi)[14]，如果液泡內(nèi)缺失水解酶A和B，API前體則不能成熟[15]。

Cvt通路通過形成Cvt小泡來運(yùn)送物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外包Cvt復(fù)合物形成Cvt小泡。與典型的分泌型運(yùn)輸小泡 (直徑50～100 nm)相比，Cvt小泡的體積要大2～27倍不等，而自噬小體的體積則要大1 000倍左右[16]。因此，在研究Cvt通路和自噬等相關(guān)現(xiàn)象時，可以通過觀察膜泡的大小來判斷膜泡是否是自噬小體，從而推測自噬的發(fā)生，并可進(jìn)一步對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜示蹤標(biāo)記，對自噬小體的運(yùn)動進(jìn)行觀察[13]。

Cvt小泡和自噬小體在形成后與液泡融合，膜融合過程是自噬發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Cvt小泡和自噬小體與液泡融合的研究也是現(xiàn)今的熱點(diǎn)。膜融合過程的機(jī)制中有相同也有不同之處，兩者與液泡融合過程均是SNARE定向機(jī)制 (Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein receptor)，且在膜融合的過程中，蛋白識別過程均需要Vam3p以及GTP酶Ypt7p參與[17-18]，而Cvt小泡與液泡融合蛋白識別過程還需要蛋白Vti1p和Vps18p[19]參與。

1.2 白念珠菌自噬基因ATG9與Cvt通路

為研究Cvt通路和自噬調(diào)控通路中的關(guān)鍵蛋白，Ohsumi等利用基因敲除和基因克隆等技術(shù)，考察了Cvt、APG系列基因?qū)湍缸允傻恼{(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)對酵母自噬具有重要調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，包括Cvt小泡相關(guān)蛋白[20]和調(diào)節(jié)激酶[21]。然而，這些蛋白都是與膜相關(guān)聯(lián)的可溶性蛋白。Apg9p/Cvt7p是Apg/Cvt通路第1個被發(fā)現(xiàn)的膜整合蛋白。在白念珠菌ATG9缺失菌中，觀察到API前體在Cvt小泡內(nèi)，但位于液泡邊緣，不能進(jìn)入液泡，這表示Cvt通路缺陷。這個現(xiàn)象與之前酵母細(xì)胞中Cvt通路缺陷的現(xiàn)象相同,并且ATG9缺失菌在缺氮培養(yǎng)基中生長缺陷，故推測ATG9在自噬早期階段，也就是小泡形成階段可能發(fā)揮作用[11]。

1.3 白念珠菌液泡相關(guān)基因與自噬

液泡是白念珠菌中生物反應(yīng)的主要中心，當(dāng)菌體與宿主相互作用時，能夠獨(dú)立調(diào)節(jié)自身pH值，增強(qiáng)菌體毒力。其中液泡膜上V-ATPase質(zhì)子泵是多亞基復(fù)合物，使液泡內(nèi)環(huán)境酸化，抑制V-ATPase V1B亞基的編碼基因VMA2的表達(dá)，使得V-ATPase不能在液泡膜上聚集且不能進(jìn)行質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)，液泡內(nèi)呈堿性，形態(tài)也發(fā)生變化。菌體內(nèi)的自噬也發(fā)生延遲，尤其是在氮饑餓的條件下，VMA2缺失或者抑制V-ATPase酶活性，自噬發(fā)生缺陷[22]，可能是液泡內(nèi)相關(guān)生物反應(yīng)影響Cvt通路運(yùn)送物質(zhì)，從而抑制了自噬的發(fā)生。

當(dāng)白念珠菌CCZ1基因缺失時，觀察到經(jīng)染色的液泡呈碎裂狀，但液泡膜的通透性和液泡內(nèi)pH并沒有改變。在誘導(dǎo)自噬的氮饑餓生長環(huán)境中，CCZ1缺失菌生長十分微弱[9]。可能由于液泡形態(tài)變化，自噬發(fā)生缺陷。

圖1 Cvt通路和自噬中包被小泡從胞質(zhì)運(yùn)向液泡的模型。兩種通路中有許多相似的機(jī)制：1.Cvt復(fù)合物形成：API在胞質(zhì)中合成，低聚成十二聚體，形成Cvt復(fù)合物；2.雙層膜小泡的形成：擴(kuò)增完成后的膜包裹Cvt復(fù)合物，形成雙膜Cvt小泡 (Cvt通路過程)或自噬小體 (自噬過程)；3.膜定向過程：雙層膜泡通過與液泡膜融合后，釋放被包裹的胞質(zhì)進(jìn)入液泡內(nèi)，這個過程稱為Cvt小泡 (Cvt通路過程)或者自噬小體 (自噬過程)進(jìn)入液泡腔內(nèi)。隨之Cvt小泡和自噬小體破裂釋放API進(jìn)入液泡腔內(nèi)，API通過蛋白酶A途徑,水解成成熟的API。這兩種通路中存在的不同之處：Cvt通路是一個選擇性的過程，Cvt小泡在包裹的過程中排除了大量的胞質(zhì)。自噬是一個非選擇性的過程，自噬小體包裹了大量的胞質(zhì)同時也包括了Cvt復(fù)合物，最終釋放入液泡。API通過Cvt小泡和自噬小體均能運(yùn)送[19]

Fig.1 A model for the transportion of coated vesicles from cytoplasm to vacuole in Cvt pathway and autophagy.There are many similar mechanisms in the two pathways:1.The formation of Cvt complex:API synthesis in the cytoplasm,oligomerization into Cvt complex;2.The formation of double membrane vesicles:the expansion and completion of membrane encapsulated Cvt complexes,the formation of double membrane Cvt vesicles (Cvt pathway) or autophagic bodies (autophagy);3.Membrane orientation process:double membrane vesicles fusion with the vacuole membrane,release cytoplasm wrapped into the vacuoles,this process is called Cvt vesicle (Cvt pathway) or autophagosomes (autophagy) into the vacuole lumen.With the release of Cvt vesicles and autophagic bodies,API released into the vacuole lumen,and API hydrolyzed into mature API through the protease A pathway.The difference between these two pathways:Cvt pathway is a selective process,Cvt vesicles in the process of the exclusion of a large number of the cytoplasm.Autophagy is a non selective process,autophagic body includes a large amount of cytoplasm and Cvt complex,which is finally released into the vacuole.API can be transported by Cvt vesicles and autophagic bodies[19]

當(dāng)液泡質(zhì)子泵功能受損使得液泡內(nèi)pH值變化，液泡發(fā)生如破裂等形態(tài)變化時，自噬缺陷。已有研究表明白念珠菌的液泡V-ATPaseV0和V1亞基對菌絲生長和菌體外分泌分別有不同作用[10]，推測在白念珠菌中，自噬可能會影響到菌絲生長和毒力，VMA2和CCZ1等液泡相關(guān)基因，也會通過自噬影響到菌體的毒力和菌絲等方面。

2 TOR通路與自噬

在哺乳動物和酵母中，TOR (Target of Rapamycin)通路的結(jié)構(gòu)和功能較為保守，Tor蛋白包含Tor1和Tor2。近期有研究表明，Tor蛋白參與胞內(nèi)氮源的利用，尤其是液泡和溶酶體內(nèi)分解代謝的氮源[23]。但在白念珠菌中，只發(fā)現(xiàn)一種Tor1同源性蛋白[24]，對調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和營養(yǎng)利用十分重要。但TOR通路如何感受胞外營養(yǎng)，目前還沒有明確結(jié)論。

2.1 白念珠菌中可能存在TOR樣自噬信號通路

在酵母中，TOR通路主要通過TorC1來調(diào)控。TORC1本身的激活依賴于小分子G蛋白Rheb，Rheb又受到具有GTP酶激活活性的TSC1、TSC2蛋白的負(fù)向調(diào)控[25]。正常生長狀態(tài)下的菌體，TorC1不受抑制，而在有限氮源等條件下，TorC1被抑制，則會誘導(dǎo)自噬發(fā)生。已有研究表明，敲除TOR2基因后的溫度敏感酵母細(xì)胞中大量表型，與氮饑餓誘導(dǎo)的自噬表型相同[26]。TorC1通過直接調(diào)控ATG自噬基因，或者間接調(diào)控蛋白的翻譯和蛋白間相互作用來調(diào)控自噬[23]，例如Tor1通過磷酸化激活作用使ATG13蛋白失活，從而抑制自噬[27]。

白念珠菌中Rhb1蛋白即為真核生物中的Rheb，其活性也受GTP酶的激活蛋白Tsc2調(diào)控。Rhb1的編碼基因RHB1，RHB1缺失菌對雷帕霉素極為敏感，另外，在誘導(dǎo)自噬的氮饑餓環(huán)境下，白念珠菌中Rhb1/Tsc2信號通路被激活，通過調(diào)控MEP2 (銨透性酶基因)誘導(dǎo)菌絲生長[28]。因此推測，Rhb1在白念珠菌中也可能參與調(diào)控TOR通路，而且通過TOR通路影響白念珠菌的自噬。已有研究發(fā)現(xiàn)，Rhb1參與細(xì)胞壁融合的調(diào)控作用也是通過Tor激酶來轉(zhuǎn)導(dǎo)的。保守的Tsc/Rheb/TOR通路是真核細(xì)胞內(nèi)諸多信號通路的交點(diǎn)[29]。因此，在白念珠菌中很有可能存在TOR樣自噬信號調(diào)控通路。

2.2 雷帕霉素通過抑制靶點(diǎn)Tor激酶誘導(dǎo)自噬

雷帕霉素 (Rapamycin)近年來被作為抗真菌藥物使用[30]，它是脂溶性大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑。白念珠菌中RBP1基因編碼肽基輔氨酰異構(gòu)酶同源性蛋白Fkbp12[31]。雷帕霉素與胞內(nèi)Fkbp12結(jié)合后，抑制了Fkbp12酶活性，并同時與FKBP12形成復(fù)合物抑制靶點(diǎn)Tor激酶活性，使Tor信號通路被阻斷，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[32]。所以，雷帕霉素可能通過抑制Tor激酶發(fā)揮抗菌作用。RBP1和TOR1缺失的白念珠菌，均表現(xiàn)出對雷帕霉素的抗性[30]。研究表明，雷帕霉素作用于菌體后，會抑制核糖體蛋白基因表達(dá)[33]，誘導(dǎo)氮抑制代謝基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[34]，以增強(qiáng)菌體適應(yīng)氮饑餓的能力。由此可見，雷帕霉素作用于白念珠菌后，抑制Tor激酶會影響菌體多方面代謝的調(diào)控，包括抑制氮源代謝和增強(qiáng)自噬。因此雷帕霉素誘導(dǎo)白念珠菌過度自噬可能是其抗真菌作用的機(jī)制之一。誘導(dǎo)自噬發(fā)生的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

另外，自噬引起的ROS增加會造成DNA損傷[2]。已有研究表明，MMS誘導(dǎo)白念珠菌DNA損傷后，特異性磷酸化絲氨酸、色氨酸的PP4磷酸酶CaPph3p和依賴金屬離子蛋白磷酸酶家族的CaPtc2p，可以通過DNA復(fù)制檢查點(diǎn)功能修復(fù)DNA損傷。而CaPTC2和CaPPH3缺失菌對雷帕霉素均敏感，且發(fā)現(xiàn)CaPTC2對CaPPH3有顯性上位作用。推測CaPTC2和CaPPH3缺失后，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬所致DNA損傷喪失了CaPph3p和CaPtc2p的修復(fù)作用，引起細(xì)胞死亡。在白念珠菌中，CaPTC2和CaPPH3是否通過Tor激酶調(diào)控自噬，尚待進(jìn)一步研究。對此相關(guān)研究，可能會揭示白念珠菌自噬調(diào)控中的一種磷酸化調(diào)節(jié)機(jī)制[35]。

2.3 白介素iL-17A調(diào)節(jié)真菌TOR通路

白介素IL-17與真菌細(xì)胞結(jié)合后，能夠阻斷病原真菌與宿主細(xì)胞的交互作用。其與白念珠菌結(jié)合后，菌體內(nèi)有21種基因上調(diào)，包括參與液泡蛋白分選的RIC1基因，并且Cvt通路中的一些基因成倍表達(dá)。除此之外，發(fā)現(xiàn)TOR通路被抑制，抑制TOR的LPF18基因也上調(diào)，自噬增加[36]。白介素IL-17是首個被發(fā)現(xiàn)對白念珠菌自噬有調(diào)控作用的細(xì)胞免疫因子，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未清楚，目前推測可能通過LPF18調(diào)控TOR通路來調(diào)控自噬。

3 在應(yīng)激條件下的白念珠菌中的自噬

3.1 氧化應(yīng)激條件

白念珠菌中，阻斷自噬通路會影響細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答的許多方面。CCZ1基因缺失導(dǎo)致液泡碎裂，使得自噬通路被阻斷。研究發(fā)現(xiàn)，CCZ1在氧化應(yīng)激中也起重要作用。在H2O2作用下，CCZ1缺失菌中的ROS水平迅速升高。使CCZ1缺失菌體自噬功能缺陷后，氧化應(yīng)激致使線粒體被破壞，同時胞內(nèi)ROS升高[9]。由此可見，當(dāng)CCZ1缺失時自噬缺陷，不能保護(hù)氧化應(yīng)激對線粒體的損傷，自噬可以增強(qiáng)白念珠菌對應(yīng)激環(huán)境的適應(yīng)性。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件

衣霉素和二硫蘇糖醇 (DTT)這兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激藥物，以及敲除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)P型Ca2+-ATP酶的編碼基因SPF1,均能使菌體內(nèi)Atg8和Lap41的自噬流增加，這表現(xiàn)為非選擇性自噬。然而衣霉素作用于SPF1缺失菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Sec63自噬流增強(qiáng)，這表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣自噬。說明大多數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件誘導(dǎo)菌體發(fā)生的是非選擇性自噬，而不是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣自噬。SPF1基因和ATG基因的雙突變株對這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激藥物很敏感，說明自噬能夠減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷。另外發(fā)現(xiàn)，SPF1缺失菌自噬功能失調(diào)，菌體對抗真菌藥物敏感，同時毒力和宿主侵襲力下降[8]?？梢姲啄钪榫械淖允煽梢詼p緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)答，且自噬缺陷使菌體的耐藥性和毒力下降。

4 小 結(jié)

自噬在細(xì)胞內(nèi)的功能是把雙刃劍，不能片面地理解自噬對菌體的作用。適度自噬有利于菌體的生長，而過度自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡則可能是抗菌機(jī)制之一。有些萜類化合物中含有有效抗菌成分，其在抗菌藥物的領(lǐng)域上有著較好研發(fā)前景，但其作用機(jī)制不明。近期有研究表明，有些萜類化合物可能通過誘導(dǎo)過度自噬發(fā)揮抗菌作用。例如香芹酚對白念珠菌的抗菌作用，可能與其促進(jìn)白念珠菌自噬相關(guān)基因和應(yīng)激基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)[37]。目前對白念珠菌自噬調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較少，相關(guān)分子機(jī)制尚未明確，但借鑒腫瘤細(xì)胞和酵母細(xì)胞中自噬機(jī)制研究方法，開展白念珠菌中自噬發(fā)生相關(guān)分子機(jī)制研究，將是未來真菌適應(yīng)性研究和抗真菌新藥靶研究的熱點(diǎn)。

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[本文編輯] 施 慧

R 379.4

B

1673-3827(2017)12-0175-05

國家自然科學(xué)基金 (81673478)

張金宇，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:rsuzhang@163.com

曹永兵,E-mail:ybcao@vip.sina.com；韓冰,E-mail:hbshcn@163.com

2017-01-04

自噬在真核細(xì)胞中保守存在的，自噬在真核細(xì)胞中是通過在溶酶體或液泡內(nèi)降解細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)并加以利用的一種非特異性行為，這對維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用。已知的自噬可分為以下三種類型:巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。在酵母細(xì)胞和大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中，自噬的發(fā)生由自噬相關(guān)基因ATG (autophagy-related gene)完成。其表達(dá)參與自噬發(fā)生的各個過程，目前已知的ATG基因超過了30種[1]。酵母和哺乳動物細(xì)胞中，自噬受到mTORC1 (mTOR復(fù)合物1)調(diào)控，激活mTORC1后自噬則被抑制。哺乳動物細(xì)胞中，自噬調(diào)節(jié)中另一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Foxo，激活態(tài)的Foxo，通過干預(yù)自噬相關(guān)蛋白的方式參與調(diào)節(jié)自噬[2]。自噬的發(fā)生影響著真核細(xì)胞的適應(yīng)性、分化和發(fā)育過程[3]。自噬對細(xì)胞具有雙重作用，適度的自噬能夠保護(hù)細(xì)胞，但自噬過度又可能導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡[4]。

白念珠菌是最主要的機(jī)會致病真菌[5]，已有研究表明，自噬在白念珠菌中也保守存在[6]，而且影響白念珠菌的毒力[7]。應(yīng)激刺激或者氮饑餓等營養(yǎng)缺陷的環(huán)境，誘導(dǎo)白念珠菌自噬增加。處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激條件下的白念珠菌，通過增強(qiáng)自噬減緩應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)菌體存活能力[8-9]。由此可見，自噬的研究將是揭示白念珠菌適應(yīng)性和耐藥性