楊益 王亞楠 蔣伶活

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

·論著·

白念珠菌CaCSC1基因的敲除和功能研究

楊益 王亞楠 蔣伶活

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

目的 構(gòu)建白念珠菌CaCSC1基因的基因缺失株，并初步探究它的功能。方法 設(shè)計(jì)長引物，通過PCR直接擴(kuò)增出帶有SAT1 flipper的CaCSC1基因敲除盒，轉(zhuǎn)化到野生型白念珠菌菌株CAI4，并通過PCR鑒定出基因型正確的轉(zhuǎn)化子,得到CaCSC1的基因缺失株。最后,通過倍比稀釋的方法進(jìn)行表型篩選。結(jié)果 成功得到CaCSC1基因的缺失菌株?；蛉笔Ь陮ν颠?(Ketoconazole)敏感，對Zn2+、Mn2+和熒光增白劑 (Calcofluor white)表現(xiàn)出耐受性。結(jié)論 CaCsc1蛋白參與對鋅離子和錳離子的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，和細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性也相關(guān)。

白念珠菌；CaCSC1基因；基因敲除；離子穩(wěn)態(tài)

[Chin J Mycol，2017，12(3):144-147]

白念珠菌 (Candidaalbicans)是臨床上最常見的人體條件致病真菌，存在于正常人體的皮膚黏膜，與其宿主免疫系統(tǒng)維持平衡的狀態(tài)[1]。當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，白念珠菌引發(fā)危及生命的系統(tǒng)性真菌感染[2]。在長期的臨床治療中，白念珠菌逐漸對一些抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性，大大降低了臨床治療的效果[3-4]。因此，研究并揭示白念珠菌的致病與耐藥機(jī)理，發(fā)現(xiàn)白念珠菌新型毒力因子，開發(fā)新型抗真菌藥物，對白念珠菌感染的治療具有重要意義。

離子通道對于細(xì)胞的生存至關(guān)重要,細(xì)胞利用離子通道進(jìn)行營養(yǎng)吸收,同時(shí)也利用通道感知環(huán)境刺激和進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[5]。在真核生物中,許多環(huán)境刺激都能引起鈣離子的跨膜流動(dòng)。鈣離子不僅參與細(xì)胞內(nèi)多種基礎(chǔ)代謝反應(yīng)，而且作為一種多功能的信號(hào)載體，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生命活動(dòng)[6-7]。擬南芥 (Arabidopsisthaliana)AtCsc1和釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)ScCsc1都是鈣離子通透性高滲刺激激活的陽離子通道 (Calcium-permeable Stress-responsive Cation channel)蛋白[8]。通過序列比對，我們在白念珠菌基因組中找到1個(gè)與釀酒酵母ScCsc1和擬南芥AtCsc1同源的蛋白CaCsc1。通過敲除CaCSC1基因，我們對其在白念珠菌細(xì)胞中的功能進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種、質(zhì)粒和引物 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

表1 菌株和質(zhì)粒

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

培養(yǎng)基 YPD液體和固體培養(yǎng)基 (酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基)：蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，加去離子水定容至1 000 mL，固體加2%瓊脂，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆?；LB液體和固體培養(yǎng)基 (Luria-Bertani培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加去離子水定容至1 000 mL，固體加2%瓊脂，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑 PCR相關(guān)試劑全部購自寶生物工程 (大連)有限公司；諾爾絲菌素 (NAT)購自Werner BioAgents公司；醋酸鋰、鮭魚精DNA (SS DNA)和聚乙二醇3350購自Sigma公司；表型篩選藥物購自Sigma公司；所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

實(shí)驗(yàn)儀器與裝置 PCR儀 (北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；核酸電泳儀 (北京六一儀器廠)；凝膠成像儀 (美國Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀 (美國Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(jī) (日立公司)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；生物超級(jí)潔凈工作臺(tái) (哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司)。

1.2 方法

菌株保存和培養(yǎng) 白念珠菌菌株保存在-80℃ YPD液體培養(yǎng)基中 (含有15%的甘油)，待用時(shí)劃線接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2 d；大腸桿菌菌株保存在-80℃ LA液體培養(yǎng)基中 (含有15%的甘油)，待用時(shí)劃線接種到LA固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。

CaCSC1基因的敲除 采用諾爾斯菌素 (NAT)的篩選標(biāo)記敲除CaCSC1基因的2個(gè)等位基因。首先設(shè)計(jì)帶有同源臂的長引物，模板為pSFS2質(zhì)粒[10]，通過PCR擴(kuò)增出NAT敲除盒。用醋酸鋰法轉(zhuǎn)染白念珠菌CAI4菌株，涂布于YPD+200 μg/mL NAT平板篩選出轉(zhuǎn)化子，提取其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。接下來將正確的轉(zhuǎn)化子接種于YPD培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，稀釋到10-5濃度后取100 μL涂布于YPD+25 μg/mL NAT平板上進(jìn)行復(fù)篩，選擇生長較小的單菌落在YPD和YPD+200 μg/mL NAT平板上劃線，選擇能在YPD平板上生長而不能在YPD+200 μg/mL NAT平板上生長的克隆，提取其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到刪除了NAT抗性基因的克隆，即完成了CaCSC1基因的1個(gè)等位基因的敲除。重復(fù)上述步驟，完成CaCSC1基因的第2個(gè)等位基因的敲除。

表型篩選實(shí)驗(yàn) 配制含藥的YPD平板，挑取單菌落接種于3 mL液體YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng) (220 r/min，30℃)，用無菌的去離子水調(diào)整菌液濃度為5×106cells/mL、5×105cells/mL、5×104cells/mL、5×103cells/mL和5×102cells/mL 5個(gè)濃度梯度，每個(gè)菌株，每個(gè)濃度梯度取2 μL點(diǎn)板。

2 結(jié) 果

2.1CaCSC1與ScCSC1編碼的蛋白具有相似的序列和結(jié)構(gòu)

用ScCsc1蛋白的氨基酸序列，從白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫 (http://www.candidagenome.org/)里，我們發(fā)現(xiàn)了1個(gè)基因位點(diǎn)C1_06270W，編碼1個(gè)913個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。序列比對分析表明它和釀酒酵母ScCsc1蛋白的相似性為61% (見圖1A)。用SMART軟件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明這2個(gè)蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，在N末端都具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在C末端都具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 (見圖1B)。

2.2CaCSC1基因的敲除及基因型驗(yàn)證結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室保存的野生型菌株CAI4為出發(fā)菌株來敲除CaCSC1基因，對CaCSC1基因的2個(gè)等位基因都采用SAT1 flipper[10]的敲除方法，敲除策略見圖2A。以pSFS2質(zhì)粒為模板，用引物CaCSC1-NAT-UP和CaCSC1-NAT-DOWN擴(kuò)增出4.7 kb的NAT敲除盒 (見圖2B)。轉(zhuǎn)化CAI4后獲得敲除了1個(gè)等位基因的雜合子 (YCA02)和敲除了2個(gè)等位基因的純合子 (YCA04)菌株。

通過PCR對它們進(jìn)行基因型驗(yàn)證。用引物CaCSC1-ORF-UP和CaCSC1-ORF-DOWN，從野生型和雜合子菌株都擴(kuò)增出663 bp的片段 (見圖2C的泳道2和3)；用引物CaCSC1-DF和CaCSC1-DR，從野生型菌株擴(kuò)增出3 592 bp的片段，從雜合子菌株擴(kuò)增出896 bp的片段 (見圖2C的泳道4和5)。用引物CaCSC1-ORF-UP和CaCSC1-ORF-DOWN，從野生型菌株擴(kuò)增出663 bp的片段，但是從純合子菌株不能擴(kuò)增出條帶 (見圖2D的泳道6和7)。用引物CaCSC1-DF和CaCSC1-DR，從野生型菌株擴(kuò)增出3 592 bp的片段，從純合子菌株擴(kuò)增出896 bp的片段 (見圖2D的泳道8和9)。這些結(jié)果表明我們得到的雜合子 (YCA02)和純合子 (YCA04)菌株都是正確的。

2.3 基因缺失株表型篩選

倍比稀釋表型篩選結(jié)果表明，相比于野生型菌株CAI4，雜合子 (YCA02)和純合子 (YCA04)菌株都對15 μg/mL的酮康唑 (Ketoconazole，KCZ)敏感，而對3 mmol/L ZnCl2和15 mmol/L MnCl2都具有耐受性 (見圖3)。此外,雜合子對450 μg/mL的熒光白 (Calcofluor white，CFW)具有微弱的耐受性，而純合子菌株對CFW具有很強(qiáng)的耐受性 (見圖3)。然而，雜合子和純合子菌株對1 mmol/L CdCl2,0.4 mol/L LiCl,0.5 mol/L MgCl2，0.6 mol/L CaCl2，1 mol/L sorbitol (山梨醇)和1.5 mol/L NaCl都沒有表型 (結(jié)果沒有顯示)。這些結(jié)果表明，CaCsc1蛋白參與對鋅離子和錳離子的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，和細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性也相關(guān)。

3 討 論

目前對于白念珠菌基因功能研究最常用的手段是基因敲除。本實(shí)驗(yàn)采用的SAT1 flipper的敲除方法可將白念珠菌中1個(gè)基因的2個(gè)等位基因進(jìn)行敲除。該方法通過設(shè)計(jì)長引物直接通過PCR擴(kuò)增出敲除盒，不需要通過克隆構(gòu)建敲除盒質(zhì)粒，節(jié)省了大量的時(shí)間。通過該方法得到的基因缺失株，最后是用FRT序列替換掉靶基因，不具有對NAT的抗性，可以用該方法構(gòu)建2個(gè)或多個(gè)基因同時(shí)缺失的菌株，而且FRT序列只有34 bp，相較于傳統(tǒng)的白念珠菌基因敲除方法Ura-Blaster[11-12]遺留下來的1 kb多的hisG序列，減小了由于外源基因片段的插入對菌株造成的未知影響。

表型篩選結(jié)果顯示csc1/csc1基因缺失株對酮康唑敏感，因此臨床耐藥的白念珠菌株中CaCSC1基因是否有高表達(dá)的現(xiàn)象值得研究。此外，對Zn2+、Mn2+和CFW表現(xiàn)出耐受性，表明CaCSC1基因在白念珠菌里不僅具有調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)的功能，而且與細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁的完整性有關(guān)[13]。前人研究表明釀酒酵母的ScCsc1和擬南芥的AtCSsc1是陽離子通道蛋白，由此我們可以推測CaCsc1蛋白在白念珠菌里也可能是一種陽離子通道。本研究成功構(gòu)建了CaCSC1基因的缺失菌株，并對它的功能進(jìn)行了初步的探究，為深入研究它調(diào)控白念珠菌細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)、致病性和耐藥的機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

圖1 CaCsc1與ScCSC1的序列比對和結(jié)構(gòu)分析 圖2CaCSC1雙等位基因的敲除原理和基因型PCR驗(yàn)證 圖3 白念珠菌雜合子CSC1/csc1 (YCA02)和純合子csc1/csc1 (YCA04)菌株的表型

Fig.1 Amino acid alignment between CaCsc1 and ScCsc1 (A) and their structural analysis (B) Fig.2 Strategy of knocking-outCaCSC1 two alleles and PCR Confirmation of Genotype Fig.3 Phenotypes of theC.albicansCSC1/csc1 andcsc1/csct1 mutants

[1] Zhu W,Filler SG.Cellular interactions ofCandidaalbicanswith human oral epithelial cells and enterocytes[J].Cell Microbiol,2010,12(2):248-271.

[2] Yu Q,Ding X,Zhang B,et al.The P-type ATPase Spf1 is required for endoplasmic reticulum functions and cell wall integrity inCandidaalbicans[J].Int J Med Microbiol,2013,303(5):257-266.

[3] Calderone RA,Fonzi WA.Virulence factors ofCandidaalbicans[J].Trends Microbiol,2001,9(7):327-335.

[4] Mayer FL,Wilson D,Hube B.Candidaalbicanspathogenicity mechanisms[J].Virulence,2011,4(2):119-128.

[5] Hou C,Tian W,Kleist T,et al.DUF221 proteins are a family of osmosensitive calcium-permeable cation channels conserved across eukaryotes[J].Cell Res,2014,24(5):632-635.

[6] Tan AR,Cai AY,Deheshi S,et al.Elevated intracellular calcium causes distinct mitochondrial remodelling and calcineurin-dependent fission in astrocytes[J].Cell Calcium,2011,49(2):108-114.

[7] Kaufman RJ,Swaroop M,Murtha-Riel P.Depletion of manganese within the secretory pathway inhibits O-linked glycosylation in mammalian cells[J].Biochemistry,1994,33(33):9813-9819.

[8] 侯聰聰.高滲脅迫門控的鈣通透陽離子通道的分離、鑒定與初步功能分析[D].北京：首都師范大學(xué),2014.

[9] Fonzi WA,Irwin MY.Isogenic strain construction and gene mapping inCandidaalbicans[J].Genetics,1993,134(3):717-728.

[10] Reuss O,Vik AR,Morschhauser J.The SAT1 flipper,an optimized tool for gene disruption inCandidaalbicans[J].Gene,2004,341(1):119-127.

[11] Dennison PM,Ramsdale M,Manson CL,et al.Gene disruption inCandidaalbicans,using a synthetic,codon-optimised Cre-loxP,system[J].Fungal Genet Biol,2005,42(9):737-748.

[12] Staab JF,Sundstrom P.URA3 as a selectable marker for disruption and virulence assessment ofCandidaalbicansgenes[J].Trends Microbiol,2003,11(2):69-73.

[13] Dichtl K,Samantaray S,Wagener J.Cell wall integrity signalling in human pathogenic fungi[J].Cell Microbiol,2016,18(9):1228-1238.

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Disruption and Functions ofCaCSC1 inCandidaalbicans

YANG Yi,WANG Ya-nan,JIANG Ling-huo

(SchoolofBiotechnology,theNationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122)

Objective To construct deletion mutants forCandidaalbicansCaCSC1 and explore its functions.Methods TheCaCSC1 knockout cassette containing the SAT1 flipper was PCR amplified using a pair of long primers.The cassette DNA was transformed into the wild type CAI4 strain,and genotypes of correct mutant strains were confirmed by PCR.Phenotypes of gene deletion mutants were screened by serial dilution assay.Results Gene deletion mutants ofCaCSC1 were successfully constructed.Deletion mutants ofCaCSC1 were sensitive to ketoconazole and tolerant against Zn2+,Mn2+and Calcofluor white.Conclusions CaCsc1 participates in the regulation of zinc and magnesium homeostasis as well as plasma membrane and cell wall integrity inCandidaalbicans.

Candidaalbicans；CaCSC1；gene knockout；ion homeostasis

國家自然科學(xué)基金 (81371784，81571966)

楊益，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:554640517@qq.com

蔣伶活,E-mail:linghuojiang@jiangnan.edu.cn

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0144-04

2017-01-20