劉景陽,劉云鵬,徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457) 2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津,300457) 3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津,300457)

谷氨酸是有機體內(nèi)氮代謝的基礎(chǔ)氨基酸之一,在生命體內(nèi)物質(zhì)代謝方面扮演著重要的角色[1-3]。由于其獨特的生理功能,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、化妝品和飼料行業(yè),成為了世界上產(chǎn)量最大的氨基酸產(chǎn)品[4-5]。目前,生物素亞適量型菌株是谷氨酸發(fā)酵較為普遍使用的菌株,具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸穩(wěn)定、提取收率高和不易染菌等優(yōu)點[6]。但從整個發(fā)酵周期來看,不難發(fā)現(xiàn)采用生物素亞適量工藝發(fā)酵時,在發(fā)酵后期菌體活力和產(chǎn)酸速率會有大幅度的下降,同時伴隨著泡沫的大量產(chǎn)生。這是由于菌體的生產(chǎn)能力不僅取決于菌體本身的性能,還必須給予菌體合適的環(huán)境,在發(fā)酵后期,培養(yǎng)基中養(yǎng)分不足以維持菌體正常生理代謝和合成產(chǎn)物的需要時,菌體活力下降,過早自溶[7],而谷氨酸菌體的衰老自溶使得菌體蛋白和膠體物質(zhì)析出,加劇泡沫的產(chǎn)生,降低氧的傳遞效率[8-9]。隨著發(fā)酵液中溶氧的降低,谷氨酸脫氫酶的活力下降,乳酸脫氫酶活力上升,胞內(nèi)氧化還原電勢升高,在其共同作用下,谷氨酸發(fā)酵的代謝流流向三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)的還原臂途徑和乳酸合成途徑,從而導(dǎo)致谷氨酸產(chǎn)量下降和雜酸產(chǎn)量的上升[10]。

全營養(yǎng)流加主要是選擇適當(dāng)?shù)娜珷I養(yǎng)培養(yǎng)，在合適的時間內(nèi)進行營養(yǎng)的補加,通過補加的營養(yǎng)來彌補菌體因生長代謝而消耗的營養(yǎng)物質(zhì),使其一直處于適宜的生活環(huán)境中,從而提高菌體活力、防止菌體衰老,進而使得代謝流充分地流向谷氨酸,避免雜酸的產(chǎn)生；采取全營養(yǎng)流加時,可以相應(yīng)地降低初始發(fā)酵培養(yǎng)基濃度,解除初期培養(yǎng)基營養(yǎng)過豐富導(dǎo)致的營養(yǎng)中毒、抑制菌體生長的問題,同時防止過高的滲透壓對菌體的抑制。

本研究以生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9為供試菌株,采用全營養(yǎng)流加的方式,通過對全營養(yǎng)流加的時間、濃度及持續(xù)流加時間進行了探究,為解決生物素亞適量型菌株發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時由于菌體活力下降所帶來的一系列問題提出建設(shè)性意見,從而提高菌體的產(chǎn)酸能力,進一步提高谷氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-谷氨酸生產(chǎn)菌：生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9,天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化斜面培養(yǎng)基

葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏10 g/L,酵母粉5 g/L,KH2PO4·3H2O 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,瓊脂粉25 g/L。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖35 g/L,玉米漿干粉15 g/L,豆?jié)?2 mL/L,K2HPO4·3H2O 3 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,蛋氨酸0.5 g/L,蘇氨酸 1 g/L,丁二酸1 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,MnSO4·H2O 5 mg/L,微量元素[Na2Mo4·2H2O 2.5 g/L，Al(SO4)3·18H2O，2.25 g/L，NiCl2·6H2O，1.6 g/L，CaCl2·2H2O，10g/L，CuSO4·5H2O，0.4 g/L]2 mL/L,VB10.5 mg/L,VB30.5 mg/L,VB50.5 mg/L,VB120.5 mg/L,氯化膽堿0.1 g/L,甜菜堿0.1 g/L。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

MnSO4·H2O 10 mg/L,MgSO4·7H2O 1.8 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L,KCl 1.8 g/L,VB10.5 mg/L,VB30.5 mg/L,VB50.5 mg/L,VB120.5 mg/L,糖蜜1.2 g/L,玉米漿干粉2.5 g/L,豆?jié)?5 mL/L,微量元素溶液2 mL/L,氯化膽堿0.1 g/L,甜菜堿0.1 g/L。

1.2.4 流加培養(yǎng)基

MnSO4·H2O 10 mg/L,MgSO4·7H2O 1.8 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L,KCl 1.8 g/L,VB10.5 mg/L,VB30.5 mg/L,VB50.5 mg/L,VB120.5 mg/L,豆?jié)?5 mL/L,微量元素溶液2 mL/L,氯化膽堿0.1 g/L,甜菜堿0.1 g/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器,天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動控制發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent 1200高效液相色譜儀,Agilent Technologies；KQ-C高壓蒸汽發(fā)生器,上海奉賢協(xié)新機電廠；752分光光度計,上海分析儀器廠；OLYMPUS生物顯微鏡,日本OLYMPUS會社。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

使用接種環(huán)每次從保藏在-80 ℃的甘油管中蘸取2～3環(huán)菌液,然后均勻接種于3支一代斜面培養(yǎng)基上,于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,之后再從培養(yǎng)好的一代斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種于二代斜面培養(yǎng)基上,于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4.2 一級種子培養(yǎng)

將3支活化好的菌種斜面分別接種到3個1 L圓底燒瓶中,每個燒瓶中含有100 mL的種子培養(yǎng)基,然后將其放置于32 ℃,220 r/min的搖床上,培養(yǎng)6～8 h。

1.4.3 二級種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的一級種子,通過發(fā)酵罐進樣口接種到含有種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,通過流加氨水,pH控制在7.0附近,溫度34 ℃,溶氧維持在30%～50%。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)

當(dāng)OD600達到15左右時,按體積分數(shù)為20%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中通過流加氨水,將pH控制在7.0附近,通過控制轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量將溶氧穩(wěn)定在30%～50%。初始發(fā)酵溫度為34 ℃,每4 h提高0.5 ℃,提至36 ℃(16 h)后至發(fā)酵結(jié)束不變,發(fā)酵時間為30～32 h。

1.5 檢測方法

1.5.1 pH的測定

采用發(fā)酵罐自帶的梅特勒pH電極進行測定,pH 6.4～8.0時采用精密pH試紙輔助測定。

1.5.2 殘?zhí)呛繖z測

每隔2 h取樣,離心取上清液,將其稀釋100倍,用生物傳感分析儀檢測殘?zhí)呛俊?/p>

1.5.3 菌體量檢測

每隔2 h取樣,分別稀釋10、20、50、100倍,用紫外可見分光光度計測量OD600,其吸光值范圍在0.2～0.8,如超過量程后需換下一個稀釋倍數(shù)。按公式(1)計算菌體生物量：

菌體生物量=OD600×稀釋倍數(shù)

(1)

1.5.4 有機酸和氨基酸的測定

使用高效液相色譜分析儀進行有機酸測定,首先,取1 mL的發(fā)酵液置于1.5 mL的離心管中,12 000 r/min離心5 min,取其上清液并進行適當(dāng)倍數(shù)稀釋,然后過0.22 μm微孔濾膜,最后采用液相色譜分析儀進行含量檢測；色譜柱條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,8 μm),0.04 mol/L硫酸緩沖液洗脫,柱溫32 ℃,流速0.4 mL/min,檢測波長為210 nm。

發(fā)酵液中氨基酸(副產(chǎn)物)含量采用氨基酸分析儀進行檢測,發(fā)酵液的預(yù)處理方式同上述有機酸測定,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,然后過0.22 μm微孔濾膜,最后使用氨基酸分析儀進行定量檢測；色譜條件：LCAK06/Na色譜柱(4.6 mm×152 mm),體積分數(shù)50%的乙腈溶液和4.1 g/L的乙酸鈉溶液為流動相,進行同時洗脫,柱溫58 ℃,流速0.50 mL/min,檢測波長為570和440 nm。

1.5.5 蛋白質(zhì)含量的測定

采用總蛋白定量測試盒進行測定[11-12]。

1.5.6 糖酸轉(zhuǎn)化率計算

按照公式(2)計算糖酸轉(zhuǎn)化率：

(2)

式中：ρ,L-谷氨酸質(zhì)量濃度,g/L；V,發(fā)酵液總體積,L；m,總耗糖量,g。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后 Dunnet t 檢驗來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 開始流加時間對L-谷氨酸生產(chǎn)的影響

分別從發(fā)酵開始后的0 h(延滯期)、2 h(對數(shù)生長期)、8 h(穩(wěn)定期)和20 h(衰亡期)開始流加體積分數(shù)為30%的流加培養(yǎng)基,通過對其菌體量和L-谷氨酸產(chǎn)量的測定,明確不同的起始流加時間對菌體生長和L-谷氨酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 開始流加時間對于GDK-9生長的影響Fig.1 Influence of the start time of feeding on the growth of GDK-9

圖2 開始流加時間對L-谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of the start time of feeding on the production of L-glutamic acid

由圖1可知,策略E為不流加發(fā)酵,最大菌體量為51,菌體量在20 h開始出現(xiàn)明顯下降。采用全營養(yǎng)流加策略后,策略A、B、C和D的最大菌體量分別達到了60、62.2、52.9和51.3,與策略E相比分別提高了17.6%、22.0%、3.7%和1.2%；菌體量出現(xiàn)明顯下降時間分別為24、24、22和20 h,分別向后推遲了4、4、2和0 h。從圖2中可以看出,策略J(不流加發(fā)酵)的L-谷氨酸產(chǎn)量為135 g/L,轉(zhuǎn)型時間為4 h。采用全營養(yǎng)流加后,策略F、G、H和I的谷氨酸產(chǎn)量分別為153、160、142和137 g/L,提升了13.3%、18.5%、5.2%和1.5%；轉(zhuǎn)型時間分別為2、2、4和4 h,分別提前了2、2、0和0 h。

經(jīng)過分析可知,0和2 h開始流加,此時為菌體的對數(shù)生長期,及時補充菌體消耗的必須營養(yǎng)物質(zhì)使得菌體一直處于最適生長狀態(tài),菌體生長速度加快,菌體量大,菌體間競爭生物素,使得菌體細胞膜通透性更好,進而轉(zhuǎn)型時間提前,產(chǎn)酸速率提高；8和20 h開始流加,一方面因為在對數(shù)生長期沒有流加,營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗,菌體生長緩慢,另一方面又因為發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素亞適量,兩方面的共同作用導(dǎo)致了單位菌體利用的生物素高于策略A和B,細胞膜通透性較差,剩余的生物素不足以支持菌體繼續(xù)增長,加上全營養(yǎng)培養(yǎng)基中不含有生物素,因此菌體量不再增長,最大菌體量相對較低、轉(zhuǎn)型慢、產(chǎn)酸速率低。發(fā)酵后期,流加的全營養(yǎng)培養(yǎng)基補充了菌體代謝所需的必須營養(yǎng)物質(zhì),進而使得菌體活力得到增強,產(chǎn)酸時間延長,菌體下降速率減緩。選擇合適的時間開始流加才能對菌體的增長和L-谷氨酸產(chǎn)量起到積極作用,因此,選擇在2 h開始流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基。

2.2 不同體積分數(shù)流加對L-谷氨酸生產(chǎn)的影響。

為了探究全營養(yǎng)培養(yǎng)基的流加體積分數(shù)對菌體發(fā)酵性能的影響,分別按全營養(yǎng)培養(yǎng)基體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%和100%配制流加液,通過發(fā)酵罐自帶的蠕動泵以0.1 r/min的流加速度進行流加,保證流加的穩(wěn)定性,從而確定最佳的流加體積分數(shù),結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 不同流加濃度對于GDK-9生長的影響Fig.3 Effect of different feed concentration on the growth of GDK-9

圖4 不同流加濃度對于L-谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different feed concentration on L-glutamic acid production

從圖3中可以看出,策略F為不流加發(fā)酵,最大菌體量為42,發(fā)酵結(jié)束的菌體量為32,菌體量下降幅度為10。采用全營養(yǎng)流加發(fā)酵時,隨著流加體積分數(shù)的增加,菌體量和菌體增長速率先升高后下降,策略A、B、C、D、E最大菌體量分別為43.1、48.7、54.1、50.5和45.7,較策略F分別增加了2.6%、16.0%、28.8%、20.2%和8.8%；發(fā)酵結(jié)束的菌體量為34、42.1、50、46和38.4,菌體量下降幅度分別為9.1、6.6、4.1、4.5和7.3,較策略F降低了9%、34%、59%、55%和27%。由圖4可知,策略L的L-谷氨酸產(chǎn)量為130 g/L,采用流加策略后,策略G、H、I、J、K的L-谷氨酸產(chǎn)量分別為136、147、163、155和140 g/L,分別提高了4.6%、13%、25.3%、19.2%和7.6%。

由上述結(jié)果可知,隨著流加體積分數(shù)的提高,菌體量和L-谷氨酸產(chǎn)量均出現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象,這是因為隨著流加體積分數(shù)的提高,補充的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸能夠彌補發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,從而提高菌體活力,大幅度緩解了菌體的衰亡速率。當(dāng)流加的體積分數(shù)超過60%時,底物抑制現(xiàn)象反而使菌體內(nèi)部各種酶的活力下降,從而導(dǎo)致菌體自身活力下降,這時,全營養(yǎng)流加對于菌體的活力提升反而不明顯[13-15]。綜上所述,最佳流加的體積分數(shù)為60%。

2.3 不同持續(xù)流加時間對L-谷氨酸生產(chǎn)的影響

從2 h開始,用發(fā)酵罐自帶的蠕動泵以0.1 r/min的恒定流速流加體積分數(shù)為60%的全營養(yǎng)培養(yǎng)基,分別采取持續(xù)流加8、16、24、30 h和不流加的策略,從而探究最佳持續(xù)流加時間。圖5和圖6為持續(xù)流加8、16、24、30 h和不流加時對發(fā)酵過程中菌體量及L-谷氨酸產(chǎn)量的測定結(jié)果。

如圖5所示,隨著流加時長的改變,不同策略間菌體量差異較大,策略E為不流加發(fā)酵,最大菌體量為51,發(fā)酵后期菌體量為38,較最大菌體量下降幅度為13；不同流加策略A、B、C、D的最大菌體量分別為63.2、66.8、67和67.3,較策略E分別提高了23.9%、30.9%、31.3%和31.9%；發(fā)酵后期的菌體量分別為53.5、58.5、61.5和62,下降幅度分別為9.7、8.3、5.5和5.3,較策略E分別降低了25.4%、36.2%、57.6%和59.2%。從圖6可知,隨著流加時長的增加,L-谷氨酸產(chǎn)量及生產(chǎn)速率逐漸提高,策略J(不流加發(fā)酵)的最終L-谷氨酸產(chǎn)量為137 g/L,策略F、G、J和I的L-谷氨酸產(chǎn)量分別為142、158、170、171.5 g/L,分別提高了3.6%、15.3%、24.1%和25.1%。

圖5 流加時長對于GDK-9生長的影響Fig.5 Effect of flow time on the growth of GDK-9

圖6 流加時長對于L-谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of feeding time on L-glutamic acid production

通過分析發(fā)現(xiàn),流加8 h時,全營養(yǎng)流加對于菌體活力的提升僅能維持在對數(shù)增長期,對于穩(wěn)定期的延長及菌體衰老死亡的緩解并不能起到作用；持續(xù)流加16 h時,穩(wěn)定期出現(xiàn)延長,但衰亡期的OD600的下降速率與不流加發(fā)酵相比并沒有明顯下變化降；持續(xù)流加24和30 h結(jié)果差距不明顯,說明當(dāng)流加超過24 h后,全營養(yǎng)流加對于菌體發(fā)酵性能的提升效果大幅下降,繼續(xù)流加反而導(dǎo)致成本的增加,因此基本確定流加24 h即可停止流加。

2.4 優(yōu)化條件下的發(fā)酵驗證

依據(jù)上述實驗所得的最佳流加發(fā)酵條件為2 h開始流加,持續(xù)24 h流加體積分數(shù)為60%的全營養(yǎng)流加培養(yǎng)基,在此優(yōu)化條件下進行3批次的發(fā)酵驗證,結(jié)果如圖7和圖8所示。

圖7 兩種發(fā)酵方式對于GDK-9生長的影響Fig.7 Effect of two fermentation methods on the growth of GDK-9

圖8 兩種發(fā)酵方式對于L-谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of two fermentation methods on L-glutamic acid production

由圖7可知,采用全營養(yǎng)流加策略后,2～8 h菌體增長速度加快,最大菌體量為66,相較于不流加發(fā)酵的53,提高了26.4%；菌體量出現(xiàn)明顯下降的時間由原來的20 h推遲到了24 h；流加發(fā)酵菌體量下降幅度為8,較不流加發(fā)酵(10)降低了20%。表明全營養(yǎng)流加通過補充菌體消耗的必需營養(yǎng)物質(zhì),起到了加快菌體生長、維持菌體活力和緩解菌體衰老死亡的積極作用。由圖8可知,不流加發(fā)酵開始產(chǎn)酸時間為4 h,而全營養(yǎng)流加發(fā)酵通過及時補加菌體生長代謝所消耗的營養(yǎng)物質(zhì),使得菌體活力提高,生長速度加快,菌體間競爭有限的生物素,從而使得菌體細胞膜通透性較不流加發(fā)酵更好,開始產(chǎn)酸時間提前到2 h,鏡檢發(fā)現(xiàn)此時部分菌體已經(jīng)開始拉長、膨大轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)酸型菌株,菌體的產(chǎn)酸速率也比不流加發(fā)酵要高。最終,流加發(fā)酵的L-谷氨酸產(chǎn)量為168 g/L,相較于不流加發(fā)酵的137 g/L,提高了23.4%。

在發(fā)酵過程中,代謝副產(chǎn)物也是影響菌體發(fā)酵性能的一大因素[16-17],因此,本研究在優(yōu)化條件下對其發(fā)酵液中的乳酸、丙氨酸及糖酸轉(zhuǎn)化率進行了測定分析,結(jié)果如圖9和表1所示。

通過對上述結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),采用全營養(yǎng)流加策略,一方面及時流加的全營養(yǎng)培養(yǎng)基解決了發(fā)酵過程中必需營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的問題,提高了菌體活力,從而提升了TCA循環(huán)的速率和通量,使得丙酮酸不會被過多積累[18-19]；另一方面,菌體活力的增加也緩解了菌體的衰老死亡,發(fā)酵后期菌體量下降幅度降低,因而產(chǎn)生的菌體蛋白也相對降低,經(jīng)測定發(fā)酵液中的可溶性蛋白含量由18.5 g/L降低到了14.9 g/L,降低了19.4%,可溶性蛋白的減少使得泡沫不再大量產(chǎn)生,保證了氧氣的傳遞效率,降低了乳酸脫氫酶等酶的活力,使得丙酮酸盡可能的流向谷氨酸[20]。因此,由丙酮酸生成的副產(chǎn)物乳酸和丙酮酸分別由不流加發(fā)酵的3.6和2.5 g/L降低到了3.1和2.06 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率也從不流加發(fā)酵的61.5%提高到了流加發(fā)酵的63%。

圖9 兩種發(fā)酵方式對于可溶性蛋白、乳酸和丙氨酸含量的影響Fig.9 Effect of two fermentation methods on the content of soluble protein, lactic acid and alanine

表1 兩種發(fā)酵方式對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Table 1 Effect of two fermentation methods on the conversion rate of sugar and acid

3 結(jié)論

本研究通過實驗分析得出,最佳流加條件為從發(fā)酵2 h開始流加,持續(xù)24 h流加體積分數(shù)為60%的流加培養(yǎng)基。在最佳流加條件下進行L-谷氨酸發(fā)酵驗證,結(jié)果顯示,在全營養(yǎng)流加條件下,菌體生長速率及菌體量明顯提高,OD600達到了66,提升了29.4%,菌體轉(zhuǎn)型時間由4 h提前到2 h,提前2 h；由于轉(zhuǎn)型時間的提前及菌體活力的提升,穩(wěn)定期時間延長了4 h,產(chǎn)酸量也得到了提高,L-谷氨酸產(chǎn)量為168 g/L,提高了約22.6%,副產(chǎn)物乳酸含量降低了13.8%,丙氨酸含量降低了17.6%,糖酸轉(zhuǎn)化率為63%,提高了1.5%。因此,全營養(yǎng)流加在提高菌體活力、加快菌體產(chǎn)酸、縮短發(fā)酵周期、提高L-谷氨酸產(chǎn)量、降低副產(chǎn)物含量方面有積極作用,對于谷氨酸行業(yè)實現(xiàn)高效發(fā)酵具有借鑒意義。