高來(lái)強(qiáng) 王海英 王學(xué)紅 李?lèi)?ài)蘭 馬強(qiáng) 張宏

(1.東營(yíng)市人民醫(yī)院皮膚科，東營(yíng) 257091；2.暨南大學(xué)真菌病研究所，廣州 510632)

·論著·

白念珠菌氟康唑耐藥株與敏感株SRB1、CDR1、ERG11表達(dá)比較分析

高來(lái)強(qiáng)1王海英1王學(xué)紅1李?lèi)?ài)蘭1馬強(qiáng)1張宏2

(1.東營(yíng)市人民醫(yī)院皮膚科，東營(yíng) 257091；2.暨南大學(xué)真菌病研究所，廣州 510632)

目的 了解SRB1在白念珠菌氟康唑耐藥株和敏感株表達(dá)差異，探討與白念珠菌耐藥性的關(guān)系。方法 使用同一親本來(lái)源的白念珠菌氟康唑耐藥株CA-16和敏感株CA-3為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法擴(kuò)增各菌株的目的基因SRB1、CDR1、ERG11，觀察各菌株目的基因表達(dá)情況。結(jié)果 與白念珠菌氟康唑敏感株CA-3相比，在mRNA水平氟康唑耐藥株CA-16的SRB1和耐藥基因CDR1、ERG11表達(dá)升高，SRB1、CDR1、ERG11表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)論 白念珠菌SRB1的表達(dá)增高和白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥密切相關(guān)，SRB1可能是一個(gè)新的耐藥候選基因。

白念珠菌；耐藥；基因；PCR；SRB1

[Chin J Mycol，2017，12(3):148-151]

白念珠菌是皮膚黏膜的常見(jiàn)寄生菌之一，在正常情況下不發(fā)病，當(dāng)致病性增強(qiáng)或宿主的免疫力損傷后可引發(fā)系統(tǒng)性念珠菌感染，在深部真菌病中白念珠菌導(dǎo)致的感染長(zhǎng)期居于首位。目前，已有多種抗真菌藥物廣泛應(yīng)用于臨床，其中最有效的是三唑類(lèi)藥物，但隨著唑類(lèi)藥物的應(yīng)用，其臨床耐藥現(xiàn)象越來(lái)越普遍，耐藥程度越來(lái)越高，從分子水平研究耐藥機(jī)制是解決耐藥問(wèn)題、開(kāi)發(fā)新藥的有效途徑。

從基因水平研究耐藥機(jī)制是目前主要的研究手段，國(guó)內(nèi)外關(guān)于白念珠菌耐藥進(jìn)行了廣泛的研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，漢防己甲素做為藥物脅迫可下調(diào)白念珠菌氟康唑敏感株Srb1p[1]，參與氟康唑抗白念珠菌的增效，srb1p是由SRB1翻譯的參與細(xì)胞壁甘露聚糖合成的關(guān)鍵催化酶，1998年Warits等[2]對(duì)釀酒酵母SRB1進(jìn)行了克隆及測(cè)序，這是對(duì)念珠菌SRB1首次系統(tǒng)性研究，考慮SRB1所處的位置及功能，結(jié)合既往發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為SRB1可能與白念珠菌耐藥相關(guān)。因此，本文通過(guò)比較白念珠菌氟康唑耐藥株和敏感株SRB1和耐藥相關(guān)基因CDR1、ERG11表達(dá)差異，探討SRB1與白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 菌株為白念珠菌氟康唑耐藥株CA-16和白念珠菌敏感株CA-3，由美國(guó)西雅圖生物醫(yī)學(xué)研究所White教授惠贈(zèng)。

主要試劑及儀器 The E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit、cDNA逆轉(zhuǎn)錄Kit、SYBR Green Real time PCR Master Mix Kit、MiniOpticonTMReal-time PCR System (Bio-Rad)、LightCycler system software (Roche Diagnostics)。

1.2 方法

總RNA提取 常規(guī)活化白念珠菌，調(diào)整酵母細(xì)胞濃度至1.5×107，離心收集細(xì)胞。按照The E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit說(shuō)明提取，棄上清，加入2 mL SE/Lyticase混合溶液重懸浮沉淀，30℃孵育30 min，每10 min輕翻轉(zhuǎn)試管1次。室溫離心5 min，完全去除上清。沉淀加入350 μL YRL buffer/β-mercaptoethanol及50 mg玻璃珠，高速渦旋5 min裂解原生質(zhì)體。離心3 min，上清轉(zhuǎn)移至新離心管。上清加等體積70%乙醇渦旋15 s徹底混勻。將液體約700 μL轉(zhuǎn)移至HiBind RNA mini column，放入2 mL collection tube，室溫離心30 s，棄上清。加入500 μL的RNA wash buffer I到column，室溫離心15 s，棄上清。置column到新2 mL collection tube，加入500 μL RNA wash buffer II，室溫離心15 s，棄上清。wash buffer II用無(wú)水乙醇配。重復(fù)操作，加入500 μL RNA wash buffer II，室溫離心15 s，棄上清。置column到新2 mL collection tube，室溫離心1 min，棄上清干燥column。將column轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加入50 μL DEPC水溶解，10 000 g離心1 min。收集樣品分裝備用，樣品經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

cDNA合成 將以上提取的RNA模板短暫離心后，將RNA模板2 μL，Oligo (dt)18 2 μL，RNase free dH2O 10 μL，各樣品混合后于70℃水浴10 min；以上樣品水浴后置冰上2 min，離心；反應(yīng)體系：5XM-MLV Buffer 4 μL，dNTP (10 mmol/L)1 μL，RNase Inhibitor (40 U/μL)0.5 μL，RTase M-MLV (RNase H-)(200 U/μL)0.5 μL；于42℃水浴1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻；得到的cDNA溶液-20℃保存。

RT-PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為20 μL，按以下組份加入PCR反應(yīng)管內(nèi)，注意操作在冰上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系:2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL+cDNA模板2 μL+dH2O 7.2 μL+基因上游引物 (10 μmol/L)0.4 μL+基因下游引物 (10 μmol/L)0.4 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；PCR擴(kuò)增定量程序：95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線使用55℃～95℃，加熱速率為每秒鐘1℃。以18S rRNA作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果應(yīng)用LightCycler system software version 3.5軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。菌株中各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量用倍數(shù)變化來(lái)表示 (2-△△Ct法)。以敏感株CA-3中各個(gè)基因的表達(dá)量作為對(duì)照，計(jì)算耐藥株CA-16的各個(gè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)[3]及使用Primer Premier 5.0軟件，序列信息見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)參基因和目的基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用 (均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，各組間的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立t檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS 19.0，P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 各目的基因表達(dá)圖

基因表達(dá)圖見(jiàn)圖1。

2.2 各目的基因表達(dá)量值

圖1 白念珠菌SRB1、CDR1、ERG11 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量，以白念珠菌氟康唑敏感株CA3為參照，各目的基因表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P<0.01，**P<0.001

Fig.1 The relative mRNA expression ofSRB1,CDR1,ERG11 in the CA-16,compared with those in the CA-3.Statistical significance of differences is indicated as follows:*P<0.01，**P<0.001

經(jīng)SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析后，各目的基因的mRNA水平相對(duì)量化及比較結(jié)果，見(jiàn)表2、3。

表2 白念珠菌耐藥株和敏感株各目的基因相對(duì)表達(dá)量值

Tab.2 The relative mRNA expression levels of genes in the CA-3 and CA-16 strains

SRB1CDR1ERG11CA-30.827±0.2010.728±0.2190.415±0.187CA-161.423±0.1621.714±0.1830.937±0.244

表3 白念珠菌耐藥株和敏感株各目的基因的表達(dá)量獨(dú)立t檢驗(yàn)的比較

Tab.3 The values of relative mRNA expression of target genes between groups were analyzed by independent samplettest

SRB1CDR1ERG11T8.7919.0986.264P0.000**0.000**0.002*

注：*P<0.01，**P<0.001

3 討 論

RT-PCR是目前最成熟、應(yīng)用最廣泛的用于檢測(cè)細(xì)胞或組織中基因表達(dá)水平的技術(shù)，具有步驟較少、耗時(shí)短、靈敏度高等特點(diǎn)，可用于多樣本、多基因的檢測(cè)。我們前期研究中使用了RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)漢防己甲素30 μg/mL作用24 h后，可抑制白念珠菌藥物外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1、FLU1的表達(dá)[4]，推測(cè)漢防己甲素在體外對(duì)氟康唑抗白念珠菌活性增效作用的分子機(jī)制與抑制藥物外排泵基因MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表達(dá)均有關(guān)。

成功進(jìn)行RT-PCR的關(guān)鍵是提取的總RNA中沒(méi)有RNA酶和基因組DNA的污染，由于白念珠菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，使用傳統(tǒng)的Trizol法提取效率差、容易降解，而硅膠柱法提取的總RNA具有高產(chǎn)量、高純度、沒(méi)有DNA和蛋白質(zhì)的污染的特點(diǎn)，因此我們選用硅膠柱法提取總RNA，提取的總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析，及紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280比值，結(jié)果顯示RNA純度較高、完整性較好、無(wú)蛋白質(zhì)污染，適合做后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。為了研究的準(zhǔn)確性，本研究在相同條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，并以其看家基因18S作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正，最終結(jié)果中某些基因的表達(dá)符合以往研究[3-4]，因此本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR的方法是可靠的。

外界刺激作用于細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，抗真菌藥物做為外界刺激作用于白念珠菌，同樣會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)抗真菌藥物不能殺死細(xì)胞時(shí)，這種應(yīng)激反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，有研究表明藥物既可以誘發(fā)耐藥性也可以引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)也可激活耐藥相關(guān)基因[5-6]。

SRB1翻譯的GDP-mannose pyrophosphorylase催化甘露糖-1-磷酸和GTP生成GDP-甘露糖[7]，通過(guò)合成細(xì)胞壁主要結(jié)構(gòu)成分甘露聚糖穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)，還可通過(guò)糖基修飾影響細(xì)胞整體功能[8]。SRB1或srb1p的表達(dá)水平與其生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，在pH 8的堿性環(huán)境中，SRB1的表達(dá)上調(diào)，pH 4時(shí)未見(jiàn)到表達(dá)水平的變化[9]，同樣在培養(yǎng)基中放入重金屬鎘時(shí)，也誘導(dǎo)了白念珠菌SRB1表達(dá)的改變[10]。SRB1是釀酒酵母生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因[11]，下調(diào)或敲除釀酒酵母SRB1可顯著影響細(xì)胞壁完整性，導(dǎo)致絮凝、結(jié)構(gòu)異常，甚至細(xì)胞溶解[12]，值得注意的是下調(diào)SRB1增強(qiáng)了對(duì)抗真菌藥物的敏感性[13]，作為一個(gè)高度保守的基因，白念珠菌SRB1與釀酒酵母的SRB1同源率達(dá)到90%[2]。因此，我們認(rèn)為白念珠菌SRB1同樣參與外界應(yīng)激信號(hào)的響應(yīng)，進(jìn)而參與白念珠菌致病及耐藥的發(fā)生。

在我們前期研究中已經(jīng)證實(shí)[14]，白念珠菌耐藥株及敏感株srb1p存在差異，在漢防己甲素對(duì)白念珠菌氟康唑敏感株作用前后srb1p表達(dá)也存在差異[1]，由于細(xì)胞在基因水平和蛋白質(zhì)水平的調(diào)控和修飾過(guò)程并不一致，差異表達(dá)的基因并不一定有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，同時(shí)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在以往的研究中并沒(méi)有對(duì)SRB1與白念珠菌耐藥的關(guān)系做過(guò)系統(tǒng)研究，因此本研究從mRNA水平檢測(cè)白念珠菌氟康唑耐藥株和敏感株之間是否有SRB1差異表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)耐藥基因CDR1、ERG11的表達(dá)，探討SRB1在白念珠菌耐藥機(jī)制中的可能作用。

結(jié)果顯示，與白念珠菌敏感株CA-3相比，氟康唑耐藥株CA-16的SRB1和耐藥基因CDR1、ERG11的mRNA水平的表達(dá)升高，表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平我們都檢測(cè)到SRB1在氟康唑耐藥株中表達(dá)變化，提示SRB1和白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥密切相關(guān)。

我們推測(cè)，白念珠菌耐藥性的形成，一般都是為了適應(yīng)藥物壓力或在應(yīng)激條件下生存而產(chǎn)生的一種適應(yīng)性變化，這種變化必然需要大量能量來(lái)維持，在白念珠菌中兩條主要的能量代謝途徑是糖酵解和有氧呼吸，白念珠菌為了生存，這兩條生成能量的途徑會(huì)加強(qiáng)，然而大部分情況下，氧氣的供應(yīng)是不充足的，也就是說(shuō)糖酵解途徑應(yīng)該在耐藥形成過(guò)程中占主導(dǎo)作用，這也在氟康唑耐藥株與敏感株差異膜蛋白質(zhì)組學(xué)中得到證實(shí)[7]。糖酵解活化階段產(chǎn)生了果糖-6-磷酸，從而進(jìn)入糖酵解下游途徑，產(chǎn)生大量ATP，而果糖-6-磷酸也是Srb1p催化合成GDP-甘露糖生物過(guò)程的中間產(chǎn)物，為了維持菌體生存，菌體一切代謝活動(dòng)優(yōu)先讓位能量代謝，共同維持糖酵解的能量生成。

另外，在耐藥性的維持階段，白念珠菌主要耐藥機(jī)制之一是細(xì)胞膜外排泵蛋白質(zhì)高表達(dá)導(dǎo)致多種細(xì)胞內(nèi)的藥物排出細(xì)胞外，這類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)家族，有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)水解ATP提供能量，外排泵蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)主要是通過(guò)CDR1、CDR2表達(dá)水平增高實(shí)現(xiàn)的，這類(lèi)泵蛋白質(zhì)功能增強(qiáng)需要更多能量維持，在RT-PCR結(jié)果中，SRB1在耐藥株中高表達(dá)，為了維持耐藥性，SRB1參與的甘露糖合成必然提供更多果糖-6-磷酸合成ATP，提示SRB1與CDR1有某種聯(lián)系，SRB1和CDR1可能在同一條通路上共同參與白念珠菌耐藥性的形成。

細(xì)胞在應(yīng)激刺激下導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，以此對(duì)抗外界環(huán)境變化，白念珠菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜緊密相連，位于細(xì)胞壁的SRB1與ERG11具有結(jié)構(gòu)上的緊密性，藥物做為一種外源性刺激同樣會(huì)導(dǎo)致SRB1異常表達(dá)，而結(jié)果中SRB1與ERG11表達(dá)差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞膜在脅迫刺激下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜成份分布或含量變化，因此我們推測(cè)SRB1也與ERG11之間存在著聯(lián)系，與耐藥的發(fā)生密切相關(guān)。

我們也觀察到SRB1在mRNA水平與蛋白質(zhì)水平表達(dá)不一致現(xiàn)象，除去蛋白質(zhì)表達(dá)比mRNA表達(dá)滯后性因素外，主要認(rèn)為srb1p參與的蛋白質(zhì)糖基化修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變影響了蛋白質(zhì)的豐度，結(jié)合文獻(xiàn)分析及研究結(jié)果，我們認(rèn)為對(duì)SRB1的研究將是一個(gè)有價(jià)值的研究方向，特別是對(duì)理解白念珠菌耐藥機(jī)制的形成和抗真菌藥物的研發(fā)提供有意義的線索。

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[本文編輯] 王 飛

Analysis of expression ofSRB1、CDR1、ERG11 in fluconazole sensitive and resistantCandidaalbicansstrains

GAO Lai-qiang1,WANG Hai-ying1,WANG Xue-hong1,LI Ai-lan1,MA Qiang1,ZHANG Hong2

(1.DepartmentofDermatology,DongyingPeople'sHospital,Dongying257091;2.InstituteofMycology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China)

Objective To investigate the differences in the expression ofCandidaalbicansSRB1 inCandidaalbicansfluconazol resistant strain and sensitive strain,and to explore the relationship betweenSRB1 and drug resistance inCandidaalbicans.Methods TwoCandidaalbicansstrains were from a same parent.We used real-time RT-PCR to observe the expression of the target genes ofSRB1,CDR1,ERG11 inCandidaalbicansfluconazole resistant strain CA-16 and sensitive strain CA-3.Result Compared with CA-3,the expression of the mRNA ofSRB1 and drug resistance geneCDR1,ERG11 in CA-16 increased.There was significant difference in the expression levels ofSRR1、CDR1andERG11 (P<0.05).Conclusion The increased expression ofSRB1 and theCandidaalbicansresistance to fluconazole was closely related,andSRB1 might be a new candidate genes associated with drug resistance.

Candidaalbicans;drug resistance;gene;PCR;SRB1

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (ZR2015PH061)

高來(lái)強(qiáng)，男 (漢族)，碩士，主治醫(yī)師.E-mail:GLQ789@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0148-04

2017-02-15