孫偉 鄧娟 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100050)

·論著·

銅綠假單胞菌脂多糖對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響

孫偉 鄧娟 蘇建榮

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100050)

目的 研究銅綠假單胞菌脂多糖 (LPS)對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響。方法 將不同濃度 (100～0.1 μg/mL)銅綠假單胞菌脂多糖與阿薩希毛孢子菌共培養(yǎng)后，利用倒置顯微鏡觀察生物膜的形態(tài)學(xué)變化，并利用甲基四氮鹽 (XTT)減低法檢測不同時間點生物膜生成量的變化。結(jié)果 與生長對照組相比，實驗組銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜的生成具有菌株差異性和LPS濃度依賴性。其中，黏附階段 (2 h)，各濃度組銅綠假單胞菌LPS對生物膜形成的影響沒有統(tǒng)計學(xué)差異。生物膜形成階段 (24 h)，與生長對照比，100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌的生物膜形成的抑制作用均有統(tǒng)計學(xué)意義作用。而在生物膜成熟階段 (48 h)，只有100 μg/mL的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌的生物膜形成的抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)意義。倒置顯微鏡下，實驗組菌絲形成明顯受到抑制，以孢子相為主。結(jié)論 銅綠假單胞菌脂多糖可以通過抑制阿薩希毛孢子菌菌絲的形成來減少生物膜的形成，并且抑制作用具有時間和濃度依賴性，以24 h時，100 μg/mL作用最為顯著。

生物膜；脂多糖；阿薩希毛孢子菌；銅綠假單胞菌

[Chin J Mycol，2017，12(3):140-143]

阿薩希毛孢子菌 (Trichosporonasahii,T.asahii)是一種可以引起免疫缺陷患者機會性感染的酵母樣真菌，是引起播散性毛孢子菌病的主要致病菌。近年來播散性毛孢子菌病的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，且病死率高，因而引發(fā)了越來越多的關(guān)注[1-5]。我們前期的研究表明，阿薩希毛孢子菌可以形成生物膜，且不同基因型別的阿薩希毛孢子菌形成生物膜的能力不同[6]。生物膜是阿薩希毛孢子菌重要的致病因子，因為生物膜的形成使其對常用抗真菌藥物的敏感性急劇下降[6-9]。因此，抑制阿薩希毛孢子菌生物膜的形成是防治播散性毛孢子菌病的重要途徑。日常工作中，我們時常發(fā)現(xiàn)阿薩希毛孢子菌與銅綠假單胞菌合并引發(fā)尿路感染的情況。而銅綠假單胞菌脂多糖 (LPS)作為銅綠假單胞菌重要的毒力因子，一方面被認(rèn)為是造成全身性炎癥綜合征的主要原因，同時LPS又具有復(fù)雜的生物學(xué)活性，是一種免疫增強劑。

本研究擬從銅綠假單胞菌脂多糖對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響的角度，探討二者的關(guān)系，希望能夠得出銅綠假單胞菌對阿薩希毛孢子菌生物膜的影響的實驗室證據(jù)，并為后續(xù)深入研究尋找新的切入點。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314；臨床清潔中段尿培養(yǎng)分離18株阿薩希毛孢子菌，所有菌株使用前均于脫脂牛奶中-70℃保存。

培養(yǎng)基 沙堡弱培養(yǎng)基 (Oxiod)；RPMI-1640 (Gibco)；YPD培養(yǎng)基 (酵母蛋白胨葡萄糖肉湯)購自Difco公司。

主要試劑和儀器 銅綠假單胞菌LPS、甲基四氮鹽 (XTT)及甲萘醌均購自Sigma公司，恒溫?fù)u床，酶標(biāo)儀 (Bio-Rad)，細(xì)胞計數(shù)板，倒置顯微鏡 (Olympus)，VITEK2 COMPCT (生物梅里埃)，MALDI-TOF-MS (生物梅里埃)。

1.2 試劑配制

YPD培養(yǎng)基 溶解10 g酵母膏，20 g蛋白胨于900 mL水中，高壓滅菌121℃，20 min。之后加入100 mL 20 g葡萄糖溶液 (過濾除菌)。

LPS工作液 RPMI-1640溶液溶液，10倍梯度稀釋配制成100～0.1 μg/mL濃度。

XTT 用無菌PBS緩沖液溶解配制成0.5 mg/mL溶液，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

甲萘醌 用丙酮 (北京化學(xué)試劑廠，分析純)新鮮配制成濃度為10 mmol/L的溶液。

1.3 方法

阿薩希毛孢子菌的分離與鑒定 收集臨床尿培養(yǎng)可疑為阿薩希毛孢子菌的菌株，取單個菌落轉(zhuǎn)種沙堡弱培養(yǎng)基，并將純培養(yǎng)物制備菌懸液通過VITEK2 COMPACT儀器鑒定，同時將單個純菌落涂布靶板，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定。將兩種方法均鑒定為阿薩希毛孢子菌的菌株收集凍存，作為試驗菌株備用。

阿薩希毛孢子菌生物膜的制備 將-70℃凍存的阿薩希毛孢子菌復(fù)蘇，沙堡弱培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種2次。取純菌落于YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜 (37℃，75 r/min)。離心、收集菌體，PBS洗滌2次 (4 000 r/min，5 min)。將菌體重懸于預(yù)先制備的含有或不含有銅綠假單胞菌LPS (100～0.1 μg/mL)的RPMI-1640溶液中，稀釋成106CFU/mL菌懸液。將1.0 mL該菌懸液加入預(yù)先放置0.8 cm×0.8 cm無菌圓形玻片的48孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)72 h。2 h時PBS緩沖液洗滌2次，重新加入400 μL相應(yīng)的含不同濃度LPS的RPMI-1640培養(yǎng)液。每隔24 h更換1次培養(yǎng)液。設(shè)置不加阿薩希毛孢子菌的空白對照組，不含LPS的RPMI-1640溶液為陰性對照組，加入阿薩希毛孢子菌但不加入LPS的生長對照組。不同時間點重復(fù)試驗3次。

XTT減低法對形成的生物膜進行定量分析在2 h、24 h、48 h時間點，棄去96孔板中培養(yǎng)液，每孔用400 μL PBS緩沖液洗滌2遍，然后每孔加入80 μL XTT、4 μL甲萘醌、316 μL PBS緩沖液，37℃避光孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值 (OD值)。

倒置相差顯微鏡觀察生物膜形態(tài) 按上述方法進行阿薩希毛孢子菌生物被膜的制備，培養(yǎng)24 h后用400 μL無菌PBS緩沖液輕輕沖洗48孔板，于倒置顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 體外不同濃度銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響

本研究考察不同時間段，100～0.1 μg/mL (10倍梯度稀釋)的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響。結(jié)果顯示：與生長對照組相比，實驗組銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜的生成具有菌株差異性和LPS濃度依賴性。其中，黏附階段 (2 h)，濃度為100 μg/mL的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌的生物膜形成抑制作用最顯著 (12/18，66.7%)。生物膜形成階段 (24 h)，100 μg/mL銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌的生物膜形成抑制率最高 (16/18，88.9%)。而在生物膜成熟階段 (48 h)，100 μg/mL和10 μg/mL的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌的生物膜形成抑制作用相當(dāng)，均為55.6% (10/18)(見表1)。具體而言，銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜的影響見XTT結(jié)果分析 (見表2)。黏附階段 (2 h)，與生長對照相比，銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜的形成的抑制作用沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而形成階段 (24 h)，與生長對照相比，100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)意義。成熟階段 (48 h)，與生長對照相比，只有100 μg/mL的的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的抑制作用具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 銅綠假單胞菌脂多糖對阿薩希毛孢子菌生物膜形態(tài)的影響

表1 不同濃度銅綠假單胞菌LPS影響阿薩希毛孢子菌形成生物膜的菌株數(shù)

Tab.1 The effect of different concentrations ofPseudomonasaeruginosaLPS influenceTrichosporonasahiibiofilms formation (strains)

時間點影響銅綠假單胞菌LPS(μg/mL)1001010.12h+0200-12400/612181824h+0000-161482/24101648h+0022-101062/881014

注：+.刺激,-.抑制,/.無影響

表2 不同濃度的銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜影響的XTT結(jié)果分析

Tab.2 XTT results analysis ofPseudomonasaeruginosaLPS againstTrichosporonasahiibiofilms formation

組別劑量(μg/mL)吸收度(OD值)2h24h48hNS-0.224±0.0701.156±0.2861.227±0.188LPS1000.172±0.0510.321±0.202*0.763±0.388*LPS100.197±0.0480.530±0.352*1.021±0.427LPS10.212±0.0680.742±0.329*1.099±0.367LPS0.10.248±0.0391.020±0.2751.220±0.224

注：NS組為生長對照組;*.與NS組比較P<0.01

將含有不同濃度銅綠假單胞菌LPS的RPMI-1640溶液培養(yǎng)的阿薩希毛孢子菌培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)阿薩希毛孢子菌生長對照組菌落纏繞聚集生長并有大量交織生長的菌絲，而實驗組菌絲抑制現(xiàn)象明顯，鏡下多見菌體為酵母相，偶見少量菌絲形成。其中實驗組濃度為100 μg/mL時，抑制作用最顯著，如圖1。

3 討 論

阿薩希毛孢子菌是引起播散性毛孢子菌病的主要病原菌，死亡率極高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，阿薩希毛孢子菌能形成生物膜，且不同基因型別的阿薩希毛孢子菌形成生物膜的能力不同。生物膜形成后，該菌對臨床常用抗真菌藥物敏感性顯著降低，甚至耐藥。因而，抑制阿薩希毛孢子菌的生物膜形成，可能是防治播散性毛孢子菌病的重要有效途徑。

在臨床菌株收集過程中，尤其是尿路感染來源的菌株，經(jīng)常遇到阿薩希毛孢子菌與銅綠假單胞菌共同感染的情況。二者的伴生感染是基于什么樣的相互作用和分子機理值得我們深入研究。本研究從最基本的現(xiàn)象入手，考慮到LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，也是重要的毒力因子，其在革蘭陰性細(xì)菌的識別、黏附、增殖以及炎癥和免疫應(yīng)答等過程中都發(fā)揮著重要作用。雖然有銅綠假單胞菌的體內(nèi)抗真菌的相關(guān)研究[10]。并且，Bandara等[11]通過共聚焦熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察到銅綠假單胞菌LPS抑制白念珠菌菌絲的形成從而影響白念珠菌生物膜的形成。但是，銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌的作用未見報道。

圖1 24 h時，不同濃度銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的形態(tài)學(xué)影響：A.陰性對照 (LPS=0 μg/mL)；B.實驗組1 (LPS=0.1 μg/mL)；C.實驗組2 (LPS=1 μg/mL)；D.實驗組3 (LPS=10 μg/mL)；E.實驗組4 (LPS=100 μg/mL)

Fig.1 The effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on the biofilm morphology ofTrichosporonasahii:A.Group NS (LPS=0 μg/mL);B.Group 1 (LPS=0.1 μg/mL);C.Group 2 (LPS=1 μg/mL);D.Group 3 (LPS=10 μg/mL);E.Group 4 (LPS=100 μg/mL)

本研究將不同濃度的銅綠假單胞菌LPS與阿薩希毛孢子菌共培養(yǎng)，XTT法分析不同時間點，銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的影響 (如表2)，并取抑制作用最顯著的第24 h，觀察生物膜形態(tài)學(xué)的變化 (如圖1)(由于條件所限，該實驗關(guān)于形態(tài)學(xué)的掃描電鏡結(jié)果將在后續(xù)試驗中加以補充)。結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌LPS對阿薩希毛孢子菌生物膜形成的抑制作用具有時間差異及濃度依賴性。與生長對照組相比，實驗組菌絲相明顯減少，以孢子相為主，可能是由于LPS主要通過抑制菌絲起作用，而黏附階段，生物膜以孢子相為主，菌絲形成尚少，所以對生物膜的形成抑制作用不顯著。為了驗證阿薩希毛孢子菌的菌絲是銅綠假單胞菌LPS的主要作用靶點，后續(xù)試驗將對銅綠假單胞菌LPS作用前后，阿薩希毛孢子菌特定菌絲基因的表達(dá)進行實時定量檢測，找出主要相關(guān)基因。另外，成熟階段 (48 h)，雖然有大量致密的菌絲形成，可以作為靶點，但是由于LPS自身也存在降解的問題，所以只有100 μg/mL的LPS顯示出顯著的生物膜抑制作用?？赡苓m時向?qū)嶒烍w系中補加適量的LPS會有一定的改善，這有待后續(xù)試驗進一步驗證。

總之，本研究初步顯示銅綠假單胞菌LPS通過抑制菌絲的形成來影響阿薩希毛孢子菌生物的膜形成，且抑制作用具有時間和濃度依賴性。后續(xù)研究將會深入探討相關(guān)分子機制，以期發(fā)現(xiàn)有效的抑制阿薩希毛孢子菌生物膜形成的靶點，并驗證去毒性的銅綠假單胞菌脂多糖是否可以成為抗真菌藥物，為減少播散性毛孢子菌病的發(fā)生提供新思路。

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[本文編輯] 施 慧

Effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on the biofilm formation ofTrichosporonasahii

SUN Wei,DENG Juan,SU Jian-rong

(ClinicalLaboratoryCenter，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity,Beijing100050)

Objective To explore the effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide on the biofilm formation ofTrichosporonasahii.Methods Morphological changes of the cells were observed by inverted microscope.And XTT reduction assay was used to elucidate the effect ofPseudomonasaeruginosalipopolysaccharide (LPS)(100-0.1 μg/mL) on biofilm formation ofTrichosporonasahii.Results Compared with the growth group,the biofilm formation ofTrichosporonasahiiwas modulated by thePseudomonasaeruginosaLPS (the experimental group) in a time and concentration dependent manner.During the adhesion stage (2 h),the difference between the growth group and all experimental groups was not statistically significant.While during the biofilm formation stage (24 h),the biofilm formation could be inhibited statistically significant when the concentration of LPS was 100 μg/mL,10 μg/mL and 1 μg/mL.And under the biofilm maturation stage,only when the LPS was 100 μg/mL,the difference between the growth group and the experimental group was significantly different.Meanwhile,when the inhibition exhibited,the hyphal formation was obviously inhibited,mainly in the spore phase under the inverted microscope.ConclusionsPseudomonasaeruginosaLPS could inhibit theTrichosporonasahiibiofilm formation in a time and concentration dependent manner.And the inhibitory effect was achieved through reducing the hyphal formation，especially in 24 h,100 μg/mL.

biofilm;lipopolysaccharide；Trichosporonasahii；Pseudomonasaeruginosa

北京市優(yōu)秀人才資助基金 (2014000021469G267)，首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床合作基金 (15JL27)

孫偉，女 (漢族)，博士，主管技師.E-mail:sunwei010512@163.com

蘇建榮,E-mail:sujr2012@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2017)12-0140-04

2016-12-22