韓雪 姜曉艷 劉悅

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NF-κB 表達與糖尿病大鼠肺損傷的關(guān)系

韓雪 姜曉艷 劉悅

目的探討糖尿病大鼠肺臟的NF-κB表達情況及NF-κB的表達增強對肺臟損傷的程度。方法30只10周齡SD大鼠隨機分為正常對照組(A 組，雌雄各5只)、糖尿病模型組(B組，雌雄各10只)，采用鏈脲菌素誘導(dǎo)建立12周糖尿病大鼠模型。模型建立12周后，全部大鼠采用20%的烏拉坦1.35 g/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉處死，并取左肺下葉固定切片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織炎癥程度，免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織NF-κB表達的陽性面積百分比。結(jié)果①肺部炎癥觀察：大多數(shù)正常對照組大鼠肺組織內(nèi)未見炎癥細胞。糖尿病模型組可見片狀炎癥細胞聚集，局部肺泡結(jié)構(gòu)消失；②NF-κB的表達: NF-κB主要表達于氣管、肺泡的上皮細胞內(nèi)。正常對照組肺組織陽性表達明顯弱于糖尿病模型組。分別對正常對照組和糖尿病模型組大鼠肺臟支氣管上皮細胞和肺泡壁上皮細胞的NF-κB的表達做秩和檢驗(P<0.05)具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論2型糖尿病大鼠模型肺組織內(nèi)時炎癥的改變程度較正常對照組相比明顯加重，NF-κB的表達增加可能是糖尿病時肺臟病變的一個重要的危險因素。

2型糖尿??； 肺損傷； 核因子κB

糖尿病是一種以糖脂代謝紊亂為特征的疾病，其病理生理過程可累及多個器官，近年研究顯示，糖尿病時可引起不同程度的肺臟損傷，這與糖尿病引起的機體免疫能功能降低、氧化應(yīng)激損傷、微血管病變以及自主神經(jīng)病變有著密切的關(guān)系[1]。2型糖尿病是一種與免疫相關(guān)的慢性炎癥性疾病。當免疫細胞累及胰島細胞時，會導(dǎo)致胰島β細胞減少，胰島素分泌失調(diào),同時糖尿病患者的高血糖癥導(dǎo)致氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[2]。而糖尿病的氧化應(yīng)激，與肺臟中的活化SOD減少，自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)活性和CD4+/CD8+下降，NF-κB活化等有關(guān)。但是糖尿病是否導(dǎo)致了肺臟中的NF-κB的表達增加仍沒有相關(guān)報道。早在20世紀70年代Schuyler等[3]就首次提出肺臟可能是糖尿病的靶器官之一。本實驗旨在通過檢測糖尿病大鼠肺臟內(nèi)的NF-κB的表達情況來研究NF-κB與糖尿病肺損傷的關(guān)系。

材料與方法

一、實驗材料

30只成年SD大鼠(雌雄各15只)隨機分為正常對照組(A 組，雌雄各5 只)、糖尿病模型組(B組，雌雄各10 只)。 糖尿病造模成功后飼養(yǎng)12周后20%烏拉坦1.35 g/kg腹腔內(nèi)注射麻醉處死大鼠均取肺左下葉, 放入4%多聚甲醛標本固定2 h。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、制蠟塊、切片厚度5～6 μm。光鏡下觀察。

二、測定方法與評價指標

1. 判定炎癥程度: 光鏡下觀察在HE染色切片上，閱讀整張切片，根據(jù)炎癥細胞的多少(主要觀察淋巴細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞)進行定級。(-)： 肺間質(zhì)無炎性細胞出現(xiàn)或散在少量炎癥細胞；(+)： 肺間質(zhì)有較多的炎性細胞浸潤，在氣管、血管周圍可見炎癥細胞呈小灶性聚集；(+++)：炎性細胞密集，成片狀分布，炎性細胞聚集處肺泡結(jié)構(gòu)消失；(++)： 炎性細胞浸潤程度介于(+)與(+++)之間。

2. NF-κB表達水平測定：免疫組化采用SP法測定組織內(nèi)的NF-κB的表達水平，于高倍鏡(×200) 下，每個標本觀察5張切片，每張切片上隨機選取10個視野，分別統(tǒng)計每個視野中NF-κB陽性著色面積并記錄，(-)：表示無表達；(±)：表示表達面積小于5%；(+)：表示表達面積在5%～30%之間；(++)：表示表達面積在30%～50%之間；(+++)：表示表達面積在50%～75%之間；(++++)：表示表達面積大于75%。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。等級資料采用秩和檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠飼養(yǎng)情況

飼養(yǎng)過程中，糖尿病組3只雄性大鼠死亡，其他大鼠均正常進入試驗。

二、糖尿病組與正常對照組在光鏡下肺部炎癥程度比較

正常對照組10只大鼠中，9只大鼠炎癥程度為(-)；1只大鼠炎癥程度為(+)。而在糖尿病組17只大鼠中，2只大鼠炎癥程度為(+)；12只大鼠炎癥程度為(++)；3只大鼠炎癥程度為(+++)。糖尿病組炎癥病變明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

三、糖尿病組與正常對照組NF-κB在支氣管壁上皮細胞表達比較

正常對照組10只大鼠中，5只大鼠NF-κB在支氣管壁上皮細胞表達程度為(±)；5只大鼠NF-κB在支氣管壁上皮細胞表達程度為(+)。而在糖尿病組17只大鼠中，11只大鼠NF-κB在支氣管壁上皮細胞表達程度為(+++)；6只大鼠NF-κB在支氣管壁上皮細胞表達程度為(++++)。NF-κB在糖尿病組支氣管壁上皮細胞表達陽性率明顯高于正常對照組，P<0.05。

四、糖尿病組與正常對照組NF-κB在肺泡壁上皮細胞表達比較

正常對照組10只大鼠中，5只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮細胞表達程度為(±)；5只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮細胞表達程度為(+)。而在糖尿病組17只大鼠中，11只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮細胞表達程度為(+++)；6只大鼠NF-κB在肺泡壁上皮細胞表達程度為(++++)。NF-κB在糖尿病組肺泡壁上皮細胞表達陽性率明顯高于正常對照組，P<0.05。

討 論

近年研究顯示，糖尿病引起的肺臟損傷，主要與糖尿病時的氧化應(yīng)激、NF-κB的活化等有關(guān)。但以NF-κB作為靶點預(yù)防和治療糖尿病肺損傷的相關(guān)報道較少。為探討NF-κB表達增強與糖尿病肺損傷的關(guān)系。本實驗通過檢測NF-κB的表達來判定糖尿病對肺的損傷。

NF-κB即核轉(zhuǎn)錄因子，是1986年由美國麻省理院癌癥研究中心的Bltimore和麻省Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所的Rwiansen發(fā)現(xiàn)的成[4]，NF-κB是廣泛存在于各種細胞胞漿內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，它通常以二聚體的形式與NF-κB 抑制蛋白( inhibitor kappa B，IκB)結(jié)合而呈無活性狀態(tài)[5]。它可被多種刺激因子激活，與IκB 解離后進入到細胞核內(nèi)，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與感染、炎癥、免疫反應(yīng)、細胞凋亡和腫瘤等病理過程。

大量的研究顯示在肺部炎癥時可以發(fā)現(xiàn)NF-κB在上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞內(nèi)表達增強。糖尿病時，由于患者血糖升高，糖化血紅蛋白生成增多，氧合血紅蛋白減少，紅細胞攜氧能力下降，加之血糖升高致血液粘稠度升高，微血管灌注不良，均可致組織細胞缺氧，促進自由基形成，導(dǎo)致炎癥的形成[6]。同時糖尿病肺損傷患者的氧化應(yīng)激導(dǎo)致肺泡上皮的損傷,增加中性粒細胞游走及轉(zhuǎn)錄因子的活動,包括轉(zhuǎn)變成腫瘤壞死因子α(TNF-α), 白介素8(IL-8)及其他炎癥介質(zhì)的k基因結(jié)合NF-κB。NF-κB增加體內(nèi)一氧化氮(NO)的水平，而NO是形成活性氧(ROS)的底物[7]，從而可降低肺的抗氧化能力導(dǎo)致肺臟損傷。

Poyneter等[8]對氣道上皮細胞內(nèi)NF-κB活化被特異性抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)這種小鼠在脂多糖刺激后，其肺部的中性粒細胞浸潤，中性粒細胞趨化因子和炎癥因子顯著減少，這提示氣道上皮細胞內(nèi)NF-κB活化可能參與了抗原誘導(dǎo)的炎癥和之后的免疫反應(yīng)。Fakhrzadeh等[9]在p50基因敲除小鼠的實驗中，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)NF-κB活性在接觸臭氧后迅速升高，并且到達高峰，而基因敲除小鼠的這個反應(yīng)被大大的緩解。研究提示肺部巨噬細胞內(nèi)NF-κB活化是肺部炎癥形成的重要原因之一 。還有實驗表明，高血糖引起的NF-κB激活的結(jié)果是增加巨噬細胞的浸潤以及增加促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的釋放[10]。

本實驗證實，2型糖尿病大鼠肺臟內(nèi)的炎癥程度明顯重于正常對照組，肺臟支氣管壁上皮細胞、肺泡壁上皮細胞的NF-κB的表達明顯增強。所以糖尿病肺部疾病的發(fā)生中NF-κB的活化是一個重要的危險因素。因此，在糖尿病患者的肺臟中抑制NF-κB的激活,可減少肺部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,并最終緩解糖尿病肺損傷[11]。通過抑制胞漿中 NF-κB活化、抑制其在的核內(nèi)轉(zhuǎn)位、抑制其在核內(nèi)與DNA的結(jié)合等途徑來防止NF-κB的活化從而達到預(yù)防和治療糖尿病肺臟病變的目的。臨床上可以選用對NF-κB的活化有抑制作用的藥物來緩解糖尿病肺損傷。

胰島素除了通過降低高血糖間接地對抗炎癥外還可以通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生, 增加抗炎因子的合成。Dandona等[12]在人體試驗中發(fā)現(xiàn)輸注胰島素能在數(shù)小時內(nèi)產(chǎn)生快速抗炎作用, 包括誘導(dǎo)NO釋放, 增加內(nèi)皮細胞NO合酶表達, 抑制NF-κB等炎癥相關(guān)因子和活性氧的濃度；影響一氧化碳合酶的產(chǎn)生從而抑制NF-κB的活化。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) 主要分布在神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞, 其活性穩(wěn)定, 能持續(xù)小量催化NO生成, 具有神經(jīng)介質(zhì)和調(diào)節(jié)局部血流作用；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶靜息時缺乏或濃度很低, 只在病理情況下才大量表達, 能催化生成大量NO, 從而導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能紊亂、血管過度擴張、組織損傷。目前研究認為, eNOS增加是眾多疾病發(fā)病的關(guān)鍵。Langouche等[13]給ICU病房的危重患者輸注胰島素強化控制血糖的一組對比研究結(jié)果表明, 胰島素的輸注能明顯抑制eNOS過度表達而顯著改善預(yù)后。Dandona等[14]研究發(fā)現(xiàn), 特異的一氧化氮合酶抑制劑能夠阻斷胰島素對ICAM21的抑制作用, 故認為NF-κB水平的降低與一氧化氮的釋放增加有關(guān)。除了胰島素外，還有研究報道，使用改善循環(huán)的藥物對炎癥時毛細血管的通透性具有強有力的減輕作用，并且使炎癥的滲出減少，從而有效促進炎癥的吸收[15]。 也有研究報道，連翹酯苷A可使肺組織中的NF-kB表達明顯下調(diào)，從而減輕炎癥反應(yīng)[16]。大黃素可破壞脂伐結(jié)構(gòu)、抑制NO 的生成、抑制NF-κB 的活化，從而下調(diào)TNF-α、IL-1β、ICAM-1、CINC-1、ELAM-1、MMP-2，MMP-9 等炎癥因子水平，從而發(fā)揮抗炎作用[17]。

本實驗證實2型糖尿病大鼠肺臟內(nèi)的炎癥程度明顯重于正常對照組，這與肺臟支氣管壁上皮細胞、肺泡壁上皮細胞的NF-κB的表達明顯增強有關(guān)。所以糖尿病肺部疾病的發(fā)生中NF-κB的活化是一個重要的危險因素。臨床上可以通過抑制NF-κB的表達來預(yù)防和治療糖尿病肺損傷。

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(本文編輯：王亞南)

韓雪，姜曉艷，劉悅. NF-κB 表達與糖尿病大鼠肺損傷的關(guān)系[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(3)： 309-312.

The relationship between expression of NF-κB and injury of lung of the diabetic rats

HanXue,JiangXiaoyan,Liuyue.

Thefirstclinicalhospital,Harbinmedicaluniversity,Harbin150001,China

JiangXiaoyan,Email:Jiangxy1963@126.com

Objective To detect the expression of NF-κB in the detection of diabetic rat lungs to study whether diabetes can lead to enhanced expression of NF-κB in the lungs resulting in lung injury of varying degrees. Methods 30 cases of 10 weeks old SD rats were randomly divided into normal control group (group A, male and female 5), diabetic model group (B group, male and female 10) with streptozotocin induced by 12 weeks diabetic rat model. Model after 12 weeks, all rats were 20% urethane 1.35 g/kg intraperitoneal injection of anesthesia were sacrificed, and were taken to the left lower lobe. The percentage of positive area of lung tissue inflammation in the degree of immunohistochemical method for detection of lung tissue NF-κB expression was observed under an optical microscope. Results ① lung inflammation observed: no inflammatory cells in the lung tissue of most of the normal control rats. Diabetic model group visible sheet inflammatory cell aggregation, the local alveolar structure disappeared; ②of NF-κB expression: NF-κB was mainly expressed in the trachea, alveolar epithelial cells, the epithelial cells of the vascular wall and expression but significantly weaker than the expression on the former two. Positive expression of normal lung tissue of the control group was significantly weaker than the DM group. Respectively rank sum test (P<0.05) with significant difference between the expression of the normal control group and diabetic model rats lung bronchial epithelial cells and alveolar wall epithelial cells, NF-κB. Conclusions NF-κB expression in type 2 diabetic rat model of lung tissue significantly increased while inflammation of the degree of change compared with control group was significantly heavier, so we have come to the conclusion of type 2 diabetes so that the lungs of rats with NF-κB expression increased, the increase in the expression of NF-κB has become an important risk factor for lung lesions of varying degrees of diabetes.

Type 2 diabetes mellitus; Lung injury; NF-κB

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.014

黑龍江省教育廳基金資助項目(1253199)

150001 哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院

姜曉艷， Email: Jiangxy1963@126.com

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2016-05-08)