孫正偉，馬 蓉，萬 安，徐漢杰，王慧妍，周 穎,趙衛(wèi)東

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ING5在對順鉑不同敏感性的卵巢癌細(xì)胞中的表達及其影響

孫正偉1,2，馬 蓉1,2，萬 安1，徐漢杰1，王慧妍2，周 穎1,趙衛(wèi)東1,2

目的 探討在對順鉑不同敏感性的卵巢癌細(xì)胞中生長抑制蛋白5(ING5)的表達情況及其影響。方法 應(yīng)用MTT法分析卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV-3、HO8910、ES-2對順鉑的敏感性差異并測定半數(shù)抑制濃度(IC50)值；Western blot法檢測ING5蛋白在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV-3、HO8910、ES-2中的表達水平；并在A2780細(xì)胞中應(yīng)用ING5 siRNA沉默ING5基因，Western blot法檢測沉默效率，MTT法檢測轉(zhuǎn)染后A2780細(xì)胞對順鉑敏感性的改變。結(jié)果 A2780細(xì)胞對順鉑的敏感性最高，IC50值為(0.423±0.020) μg/ml；而ES-2細(xì)胞對順鉑的敏感性最低，IC50值為(5.280±0.309)μg/ml(P<0.01)。然而，ING5蛋白在A2780細(xì)胞中表達最高，在ES-2細(xì)胞中表達最低(P<0.01)。ING5 siRNA顯著降低A2780細(xì)胞對順鉑的敏感性(P<0.01)。結(jié)論 ING5的高表達可能有利于提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

卵巢癌細(xì)胞；順鉑；耐藥；生長抑制蛋白5

卵巢癌是婦科癌癥死亡的主要原因,主要由于卵巢癌早期難以診斷和在化療過程中逐漸形成的化療耐受。標(biāo)準(zhǔn)治療為腫瘤減滅術(shù)和術(shù)后以鉑類為第一線的化療。盡管治療后初期有效率較高，但頻繁復(fù)發(fā)和逐漸獲得的化療耐受最終導(dǎo)致治療失敗。因此，卵巢癌患者5年總體生存率只有約30%[1]。化療耐受成為成功治療卵巢癌的主要障礙，尤其是鉑類耐藥。研究卵巢癌耐藥的分子機制是提高卵巢癌治療效果的重要舉措。有研究[2]表明，在體內(nèi)生長抑制蛋白5(inhibitor of growth protein 5,ING5)能夠和p300、p53相互作用，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，其過表達能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)ING5的功能研究很少，該研究通過Western blot法檢測卵巢癌細(xì)胞系中ING5的表達，探討ING5在卵巢癌細(xì)胞系中的表達與對順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡敏感性之間的關(guān)系及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢癌細(xì)胞系ES-2、HO8910、SKOV-3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；A2780細(xì)胞系購自北京協(xié)和腫瘤細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen公司)、RPMI Medium-1640、DMEM、McCoy’s 5A(美國Gibco公司)；MTT(美國Sigma公司)；兔抗人ING5單克隆抗體、小鼠抗人GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠/兔抗體(美國Abgent公司)；增強化學(xué)發(fā)光劑(ECL)A液、B液(美國Pierce公司)；ING5 siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞系ES-2、SKOV-3用含有10%FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，HO8910細(xì)胞系用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，A2780細(xì)胞系用含有10%FBS的RPMI Medium-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot法檢測蛋白表達 貼壁的細(xì)胞用冰冷的PBS沖洗3次后，收集細(xì)胞入EP管中，重懸，加入1×蛋白裂解液。將蛋白樣品調(diào)整濃度后等量加入12%的SDS-聚丙烯凝膠電泳分離。在TanonEPS200電轉(zhuǎn)系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)膜，將樣品蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h。孵育一抗、二抗。然后轉(zhuǎn)入暗室加ECL發(fā)光液，曝光顯影，掃描灰度值。

1.2.3 MTT法檢測順鉑IC50值 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，分別給予所確定的5個梯度濃度(0.032、0.16、0.8、4、20 μg/ml)的順鉑處理。孵育72 h后，每孔加入5 mg/ml 15 μl MTT 試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。去除培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO溶解甲瓚，搖床輕輕搖晃10 min，完全溶解甲瓚。使用酶標(biāo)儀于570 nm波長測吸光度(optical density,OD)值。通過Msvbvm50軟件計算使細(xì)胞抑制率為50%時的順鉑濃度。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染的前1 d，根據(jù)實驗要求準(zhǔn)備細(xì)胞、雙無培養(yǎng)基。用不含血清的配套培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000,輕輕混合，室溫孵育5 min。用不含血清的培養(yǎng)基稀釋ING5 siRNA,輕輕混合，陰性對照(negative control,NC)用無關(guān)序列寡聚物。稀釋好的Lipofectamine 2000經(jīng)過5 min孵育后，分別與上述ING5 siRNA及NC輕輕混和，室溫靜置20 min以形成核酸-Lipo2000混合物。將核酸-Lipo2000混合物加入含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕使之混合均勻。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，6 h后除去轉(zhuǎn)染試劑，加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至檢測時間，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780細(xì)胞系對順鉑的IC50值 A2780細(xì)胞對順鉑的IC50值最低為(0.423±0.020) μg/ml，其次是SKOV-3(0.833±0.028)μg/ml、HO8910(1.737±0.032)μg/ml，對順鉑的IC50值最高的是ES-2細(xì)胞為(5.280±0.309)μg/ml，大約是A2780細(xì)胞IC50值的12.48倍。與A2780細(xì)胞IC50值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=199.9,P<0.01)。

2.2 ING5蛋白在ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780細(xì)胞系中的表達 A2780細(xì)胞ING5蛋白表達最高，其次是HO8910、SKOV-3，而ES-2細(xì)胞ING5蛋白表達最低，明顯低于A2780細(xì)胞。與A2780細(xì)胞ING5蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=367.7,P<0.01)。見圖1。

2.3 ING5 siRNA降低了A2780細(xì)胞系對順鉑的敏感性 分別在A2780細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ING5 siRNA和NC, Western blot法檢測ING5蛋白的表達，與NC相比，轉(zhuǎn)染ING5 siRNA組中ING5蛋白的表達明顯下調(diào)(t=9.151,P<0.01)。見圖2。MTT法檢測轉(zhuǎn)染ING5 siRNA和NC后A2780細(xì)胞對順鉑敏感性的變化，結(jié)果表明，與NC(IC50：1.020±0.187 μg/ml)相比，轉(zhuǎn)染ING5 siRNA后，A2780細(xì)胞對順鉑的敏感性(IC50：7.057±0.207 μg/ml)顯著下調(diào)(t=37.030,P<0.01)。

圖1 Western blot法檢測ING5蛋白在ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780細(xì)胞系中的表達與A2780比較：**P<0.01

圖2 Western blot法檢測ING5蛋白在轉(zhuǎn)染ING5-NC、ING5-siRNA的A2780細(xì)胞系中的表達與ING5-NC組比較：**P<0.01

3 討論

卵巢癌是所有婦科腫瘤中死亡率最高的，因為其通常只有在晚期才能得到確診，并且患者的預(yù)后取決于其對化療藥物的敏感性。然而，原發(fā)或者逐漸獲得的化療耐受，特別是對鉑類耐受限制了治療的效果。雖然藥物抗性的發(fā)展過程似乎是多因素的，但藥物抗性的獲得主要是由于細(xì)胞凋亡的失活，這也通常被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志之一。這表明重新激活凋亡反應(yīng)可能是對抗化療耐受的有效方法[3-4]。從酵母菌到人類，生長抑制蛋白(inhibitor of growth protein,ING)在進化上都是高度保守的同源蛋白[5]。5個不同的ING基因座分布于小鼠和人類的整個基因組中[6]。其中ING5基因是Ⅱ型抑癌基因ING家族的5個不同成員之一[7]。ING5蛋白含有一個同源結(jié)構(gòu)域，其是ING蛋白家族的一個高度保守的區(qū)域，該區(qū)域與染色質(zhì)重塑激活有關(guān)[7-8]。Doyon et al[9]證明ING5的同源結(jié)構(gòu)域能夠促進局部組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的激活，刺激染色質(zhì)重塑以及調(diào)節(jié)基因的表達。Shiseki et al[2]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達ING5導(dǎo)致細(xì)胞集落形成減少，S期比例下降以及凋亡增加。最近的研究[10]顯示在口腔鱗狀細(xì)胞癌中ING5 mRNA發(fā)生突變和下調(diào)，表明其是一種抑癌基因。

本研究通過MTT法檢測ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780卵巢癌細(xì)胞系對順鉑的相對IC50值，發(fā)現(xiàn)對順鉑的IC50值由低到高的順序為A2780、SKOV-3、HO8910、ES-2，并且ES-2的IC50值大約為A2780的12.48倍。進一步通過Western blot檢測ING5蛋白在ES-2、HO8910、SKOV-3、A2780細(xì)胞系中的表達情況，結(jié)果ING5的表達由高到底的順序為A2780、SKOV-3、HO8910、ES-2。結(jié)果顯示高表達ING5的A2780細(xì)胞對順鉑最敏感，于是通過在A2780細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ING5 siRNA及NC并分別檢測對順鉑的IC50值，與NC相比，轉(zhuǎn)染ING5 siRNA后，A2780細(xì)胞對順鉑的耐受性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而最近的研究[11]表明，ING5在多藥敏感的膀胱癌細(xì)胞系5637中高表達，在多藥耐受的膀胱癌細(xì)胞系H-bc中低表達。在5637中沉默ING5后導(dǎo)致其敏感性降低，而在H-bc中過表達ING5后使其敏感性提高。本研究結(jié)論與其相類似。有研究[11]顯示，ING5在膀胱癌細(xì)胞系中是miR-193a-3p的直接下游靶點，并且參與DNA損傷反應(yīng)信號通路的調(diào)節(jié)。ING5在卵巢癌細(xì)胞系中的調(diào)節(jié)機制和參與的信號通路有待進一步研究。故針對本研究的不足之處，下一步的研究重點是在低表達ING5蛋白的卵巢癌細(xì)胞系中過表達ING5后檢測其對順鉑耐藥性的影響，同時，尋找在卵巢癌細(xì)胞系中調(diào)節(jié)ING5的miRNAs基因并作進一步的機制研究。

綜上所述，ING5能夠促進卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780對順鉑的敏感性，這可能為臨床檢測卵巢癌患者預(yù)后及對順鉑的敏感性提供了新的分子標(biāo)志物，為克服卵巢癌順鉑耐受提供了新思路。

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Expression and influence of ING5 on cisplatin sensitivity in different ovarian cancer cells

Sun Zhengwei1,2,Ma Rong1,2, Wan An1,et al

(1Dept of Obstetrics and Gynecology,The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230001；2DeptofGynecologicTumor，AnhuiCancerHospital,Hefei230000)

Objective To investigate the expression level and effect of inhibitor of growth protein 5(ING5) in ovarian cancer cell which has different sensitivity to cisplatin. Methods MTT method was used to analyze the sensitivity of difference in ovarian cancer cell line A2780, SKOV-3, HO8910, ES-2 to cisplatin,and to determine the 50% inhibiting concentration (IC50) value; the expression level of ING5 protein in A2780, SKOV-3, HO8910 and ES-2 cells was determined by Western blot; SiRNA against ING5 was used to silence ING5 gene and the knockdown efficiency was verified by Western blot,and the change of the sensitivity to cisplatin in A2780 cells after transfection was detected by MTT method.Results A2780 was the most resistant cell line to cisplatin, which IC50 value was (0.423±0.020) μg/ml; ES-2 was the most resistant cell line to cisplatin, with IC50 value of (5.280±0.309) μg/ml (P<0.01). However, ING5 protein level was the highest in A2780 cells, but the lowest in ES-2 cells(P<0.01). Knockdown of the ING5 by siRNA significantly reduced the sensitivity of A2780 cells to cisplatin(P<0.01).Conclusion High expression of ING5 might improve the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin.

ovarian cancer cells; cisplatin; drug resistance; ING5

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.026.html

安徽省科技廳年度重點科研項目(編號：1301043053)

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230001

2安徽省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，合肥 230000

孫正偉,男,碩士研究生；

趙衛(wèi)東,男,副教授,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,責(zé)任作者，E-mail:victorzhao@163.com

R 711.75

A

1000-1492(2016)01-0056-04

2015-10-20接收