李 松，叢 林，袁 靜，方慧琴，陳 薇，李 琴，楊 琴

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TLR4乙?；瘜PS-TLR4-NF-κB通路的影響及其在妊娠期糖尿病發(fā)病機制中的作用

李 松，叢 林，袁 靜，方慧琴，陳 薇，李 琴，楊 琴

目的 研究Toll樣受體4(TLR4)乙?；谌焉锲谔悄虿?GDM)孕婦外周血單核細胞(PBMC)中的表達及其在內(nèi)毒素(LPS)-TLR4-核因子κB(NF-κB)通路中的作用，進一步探討GDM的炎癥發(fā)病機制。方法 選取正常孕婦、GDM孕婦各30例，抽取靜脈血15 ml，密度梯度離心法分離PBMC進行體外培養(yǎng)，并保留血清用于檢測LPS的量；將研究分成正常組(對照組)、正常+LPS組、GDM組和GDM+LPS組。PBMC用于免疫共沉淀法、Western blot法檢測TLR4乙?；蚇F-κB蛋白的表達量；上清液用于ELISA法檢測炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)的水平。結(jié)果 正常孕婦、GDM孕婦體內(nèi)LPS量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GDM組發(fā)生TLR4乙?；兓?，而對照組未檢測到TLR4乙?；?；LPS干預(yù)后，正常+LPS組、GDM+LPS組TLR4乙?；某潭让黠@增加，且GDM+LPS組TLR4乙?；潭让黠@高于GDM組和正常+LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4組NF-κB的表達和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-10水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組TLR4乙?；cNF-κB蛋白表達量之間具有正相關(guān)性(P<0.05)。 結(jié)論 TLR4乙?；ㄟ^影響LPS-TLR4-NF-κB通路的活化介導(dǎo)炎癥因子的釋放，促進孕婦體內(nèi)抗炎-致炎的失衡，從而參與GDM的發(fā)生。

妊娠期糖尿病；炎癥；Toll樣受體4；乙?；?/p>

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)的發(fā)病率在逐年上升，其近、遠期并發(fā)癥給母兒健康帶來了嚴(yán)重的危害。為預(yù)防和治療GDM，其發(fā)病機制的研究顯得尤為重要。目前認(rèn)為，胰島功能受損、胰島素抵抗(insulin resistant，IR)是GDM的主要病因。GDM孕婦體內(nèi)慢性炎癥狀態(tài)、抗炎-致炎失衡、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)途徑等參與了胰島功能受損和IR的形成過程[1-2]。GDM也被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病。TLR4過度表達導(dǎo)致的機體異常炎癥反應(yīng)狀態(tài)已成為許多炎癥性疾病的病理基礎(chǔ)[3]。前期研究[4]證實內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)- Toll樣受體4(TLR4)-核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路激活導(dǎo)致的炎癥因子的釋放可能參與了GDM的發(fā)病。蛋白質(zhì)乙?；且环N動態(tài)可逆的翻譯后修飾，在調(diào)控蛋白質(zhì)功能上具有簡單的開關(guān)作用[5-6]。文獻[7]報道，經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)后，單核細胞內(nèi)TLR4可發(fā)生乙?；?，并且正向調(diào)控炎癥通路的激活及炎癥因子的表達。目前關(guān)于TLR4乙?；贕DM體內(nèi)是否表達并發(fā)揮一定作用仍不明確。該研究旨在通過探討TLR4乙?；贚PS-TLR4-NF-κB通路中的作用，進一步闡述GDM的炎癥發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌實驗室行口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)的妊娠24～28周的孕婦為研究對象，GDM孕婦、正常孕婦各取30例。GDM的納入采用國際妊娠期糖尿病研究組(IADPSG)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，同時排除GDM的高危因素。GDM孕婦年齡21～34(31.04±2.67)歲，孕24～28(26.24±1.26)周；正常孕婦年齡22～34(30.91±1.60)歲，孕24～28(25.68±3.41)周，且兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究獲得受試者知情同意，并經(jīng)我院倫理委員會討論通過。

1.2 試劑 Ficoll淋巴細胞分離液(上海華精生物公司)；LPS、臺盼藍(美國Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；RIPA裂解液、5×和2×蛋白上樣緩沖液、蛋白A+G瓊脂糖珠(上海碧云天公司)；小鼠抗人TLR4抗體、小鼠抗人泛乙?；嚢彼峥贵w(英國Abcam公司)；小鼠抗人NF-κB p65抗體、β-actin(美國CST公司)；山羊抗小鼠二抗(北京中杉公司)；ECL顯影液(美國Thermo公司)； 鱟試劑盒(廈門鱟試劑公司)； ELISA試劑盒(上海源葉生物科技公司)。

1.3 標(biāo)本采集與細胞培養(yǎng) 采集受試者晨起空腹靜脈血15 ml，室溫靜置30 min后血液不凝。Ficoll淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，洗滌提純后細胞計數(shù)板計數(shù)，臺盼藍測定細胞活力(>95%)。調(diào)整細胞濃度后，將細胞接種于24孔板內(nèi)，加RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清，青、鏈霉素1 ml/100 ml)將每孔總體積調(diào)至1 ml，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實驗分組 細胞培養(yǎng)48 h后，向24孔板內(nèi)加入終濃度為1 μg/ml的LPS干預(yù)24 h，每種處理設(shè)3個復(fù)孔，并將處理后的細胞標(biāo)記為正常組(對照組)和正常+LPS組、GDM組和GDM+LPS組。24 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。LPS濃度設(shè)定參考前期實驗[9]。

1.5 血清LPS含量的檢測 血清LPS檢測按照鱟試劑盒說明書操作。

1.6 Western blot法檢測NF-κB p65的表達 RIPA裂解細胞，離心取上清液加入5×蛋白上樣緩沖液，煮蛋白10 min。10%SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后放入NF-κB p65抗體(1 ∶250)和β-actin(1 ∶1 000)中4 ℃過夜。洗膜，放入二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育2 h，ECL顯影液顯影。采用Image J和GraphPad Prism5.0分析軟件進行蛋白顯影后圖像分析。

1.7 免疫共沉淀法和Western blot法檢測TLR4乙?；谋磉_ 冰上裂解細胞，離心取上清液置于離心管中加入2 μg TLR4抗體。離心使其向離心管內(nèi)加入再懸浮后的蛋白A+G瓊脂糖珠20 μl；4 ℃孵育過夜；離心使顆粒沉淀，棄上清液；顆粒洗滌3遍，每次離心均棄上清液；加2×蛋白上樣緩沖液10 μl重懸沉淀物；煮沸10 min。12.5%SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后放入泛乙?；贵w(1 ∶800)和TLR4抗體(1 ∶400)中4 ℃過夜。洗膜，放入二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育2 h，ECL顯影液顯影。采用Image J和GraphPad Prism5.0分析軟件進行蛋白顯影后圖像分析。

1.8 ELISA法檢測腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)的水平 培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1、IL-10的檢測均按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 血清LPS的檢測結(jié)果 GDM組血清LPS水平[(0.92±0.03) IU/ml]明顯高于對照組[(0.53±0.02)IU/ml]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 TLR4乙?；臋z測結(jié)果 GDM組檢測到TLR4發(fā)生乙酰化修飾，而對照組TLR4則未檢測到乙酰化的修飾。LPS干預(yù)培養(yǎng)后，正常+LPS組和GDM+LPS組TLR4乙?；某潭染@著增加，且GDM+LPS組高于GDM組和正常+LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組 TLR4乙酰化的水平

2.3 Western blot法檢測NF-κB p65表達的結(jié)果 GDM組NF-κB p65的表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)處理后，正常+LPS組、GDM+LPS 組NF-κB p65的表達明顯高于對照組，GDM+LPS組高于正常+LPS組和GDM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-10的表達結(jié)果 GDM組、正常+LPS組、GDM+LPS組TNF-α、IL-1、IL-10的表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LPS干預(yù)處理后，正常+LPS組TNF-α、IL-1、IL-10的表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), GDM+LPS組高于正常+LPS組和GDM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組TNF-α、IL-1、IL-10表達水平的比較

與對照組比較：*P<0.05；與GDM+LPS組比較：#P<0.05

圖2 各組NF-κB p65的水平

圖3 各組TNF-α、IL-1、IL-10的水平

A：TNF-α；B：IL-1；C：IL-10；與對照組比較：*P<0.05；與GDM+LPS組比較：#P<0.05

2.5 各組TLR4乙酰化、NF-κB p65蛋白表達的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，GDM組、正常+LPS組、GDM+LPS組TLR4乙?；?、NF-kB p65蛋白表達量之間呈正相關(guān)性(r=0.901、0.870、0.942，P<0.001)。

3 討論

TLR4為Ⅰ型跨膜蛋白受體，在其介導(dǎo)的炎癥通路中具有“閘門”的作用[10]。NF-κB是TLR4信號通路下游最重要的介質(zhì)，激活后的NF-κB進入細胞核與靶基因特定序列結(jié)合，促進炎癥因子的合成和釋放。LPS-TLR4-NF-κB是TLR4信號通路中的經(jīng)典炎癥通路，現(xiàn)已成為GDM炎癥發(fā)病機制的研究熱點。研究[1]表明，單核細胞內(nèi)TLR4 mRNA和蛋白表達的增加與GDM的發(fā)生密切相關(guān)，前期研究[4,9]則通過對TLR4、NF-κB mRNA及炎癥因子表達的相關(guān)性分析得出，LPS-TLR4-NF-κB通路的激活是GDM發(fā)病的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)乙?；侵匾姆g后修飾過程，不僅在細胞核內(nèi)具有重要作用，同時調(diào)控著不同的細胞質(zhì)過程，包括細胞的骨架動力學(xué)、能量代謝、內(nèi)吞、細胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[11]。TLR4蛋白存在翻譯后修飾，包括甲基化、乙?；?、磷酸化等，其中乙?；龠M炎癥因子的表達，其存在是TLR4炎癥通路活化的必要條件。

本研究顯示，GDM孕婦外周血LPS含量高于正常孕婦，且TLR4乙?；男揎梼H存在于GDM孕婦PBMC，而正常孕婦并未檢測到TLR4乙?；兓涣硗?，GDM組炎癥因子TNF-α、IL-1和IL-10的表達水平高于對照組，這與前期研究[4,9]和國外的報道[12]是一致的。妊娠期孕婦體內(nèi)環(huán)境會發(fā)生適應(yīng)性改變，腸道菌群產(chǎn)生的LPS可異位進入外周循環(huán)，進入外周循環(huán)后的LPS除可獨立誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IR外，還可誘導(dǎo)多種細胞的TLR4活化，激活炎癥通路[13]。推測LPS可能通過上調(diào)TLR4乙?；M而影響炎癥通路的活化，促進了炎癥因子的表達。進一步研究顯示，LPS干預(yù)培養(yǎng)后，正常+LPS組、GDM+LPS組TLR4乙?；谋磉_明顯增加，且GDM+LPS組明顯高于GDM組和正常+LPS組，提示配體的增加對TLR4乙酰化的表達有促進作用。GDM孕婦體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和代謝的紊亂，如飽和脂肪酸、活性氧自由基、熱休克蛋白等的增加[14]，這些均可作為TLR4的內(nèi)源性配體，GDM孕婦體內(nèi)紊亂的代謝環(huán)境可能促進了TLR4乙?；谋磉_介導(dǎo)炎癥因子的釋放，導(dǎo)致GDM疾病的進展，但這些有待于進一步研究證實。

IL-1、TNF-α、IL-10的升高可導(dǎo)致IR的形成和胰島功能的損傷。另外，IL-10不僅是體內(nèi)最重要的抗炎細胞因子，還可作為NF-κB的抑制劑，抑制炎性細胞產(chǎn)生炎癥因子，從而影響炎癥反應(yīng)的強度。本研究中，LPS干預(yù)培養(yǎng)后，TNF-α、IL-1和IL-10的表達水平明顯增高，且GDM+LPS組高于正常+LPS組；此外，IL-10的升高幅度低于TNF-α和IL-1。說明GDM孕婦體內(nèi)低度炎癥狀態(tài)可能通過增加TLR4乙?；拿舾行詮亩觿×丝寡?致炎的失衡。

TLR4乙酰化和NF-κB蛋白表達的相關(guān)性分析，也說明了TLR4通過翻譯后的乙?；揎椬饔谜{(diào)控著孕婦體內(nèi)LPS-TLR4-NF-κB通路的活化程度。本研究僅在體外環(huán)境下進行，然而人體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境是否對TLR4乙?；揎棶a(chǎn)生影響，仍需要大量研究來證明。目前，針對蛋白質(zhì)乙?；乃幬镆言谥委熌[瘤等疾病上取得了一定的成果[15]。后期研究將會對TLR4的乙酰化位點進行檢測，并評估這些位點的作用，以期為GDM的靶向治療提供理論依據(jù)。

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Li Song,Cong Lin,Yuan Jing,et al

(PrenatalDiagnosisCenter,DeptofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Effect of TLR4 acetylation on LPS-TLR4-NF-κB pathway and its role in pathogenesis of gestional diabetes mellitus

Objective To study TLR4 acetylation for analysing the expression in peripheral blood mononuclear cells of gestional diabetes mellitus(GDM) patients, and the impact on LPS-TLR4-NF-κB pathway, discussing the inflammatory pathogenesis of GDM. Methods 30 normal pregnant women and 30 GDM patients were picked and 15 ml peripheral blood was drawn per subject respectively. Peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were extractedviadensity gradient centrifugation and were culturedinvitro, Serum was used for detecting the level of lipopolysaccharide(LPS). The research was divided into four groups: normal group (control group), normal+LPS group, GDM group and GDM+LPS group. PBMC were adopted into immunoprecipitation and Western blot was used to detect the expression of TLR4 acetylation, the supernatant was used in ELISA for detecting different levels of inflammatory cytokines,TNF-α,IL-1 and IL-10. Results Levels of LPS were statistically significant in woman with GDM and normal pregnant woman(P<0.05). TLR4 acetylation appeared in GDM group, and was negative in the control group.After the LPS intervention,the degree of TLR4 acetylation was enhanced evidently in both normal+LPS group and GDM+LPS group. And the latter was obviously higher than that of GDM group and normal+LPS group (P<0.05). The differences among levels of these four inflammatory cytokines,TNF-α,IL-1 and IL-10, had stastistical significance(P<0.05). There was a positive correlation between TLR4 acetylation and NF-κB protein expression levels(P<0.05).Conclusion TLR4 acetylation mediates the release of inflammatory cytokines by influencing the activation of LPS-TLR4-NF-κB pathway, which contributes to promoting antiinflammatory-proinflammatory imbalance in pregnant woman, thereby involves in the occurrence of GDM.

gestional diabetes mellitus;inflammation;TLR4;acetylation

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.014.html

安徽省自然科學(xué)基金項目(編號：1208085MH172)，安徽高校省級自然科學(xué)研究項目(編號：KJ2011Z215)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心，合肥 230022

李 松，男，碩士研究生；

叢 林，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: conglin1957@163.com

R 714.5

A

1000-1492(2016)01-0026-05

2015-10-20接收