金 瑋，吳 萍

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Mcl-1 siRNA對TRAIL誘導胃癌細胞凋亡的影響

金 瑋1，吳 萍2

目的 探討轉(zhuǎn)染髓樣細胞白血病(Mcl-1)siRNA特異性沉默Mcl-1基因?qū)δ[瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TRAIL)誘導胃癌細胞HGC-27凋亡的影響。方法 采用碘化丙啶(PI)染色法流式細胞術(shù)分析TRAIL單獨作用的細胞凋亡率以及廣譜caspase抑制劑z-VAD-fmk對細胞凋亡的抑制作用；Western blot法分析TRAIL處理前后半胱天冬酶-3(caspase-3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)的活化以及抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1的蛋白表達情況；采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA入HGC-27細胞，Western blot 法驗證基因沉默效果，流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率的變化。結(jié)果 HGC-27細胞對TRAIL不敏感，48 h的凋亡率僅為(20.65±3.23)%，z-VAD-fmk能幾乎完全阻止TRAIL誘導的凋亡；TRAIL作用晚期caspase-3活化、PARP-1裂解，Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1在TRAIL處理前后沒有明顯的變化；Mcl-1 siRNA轉(zhuǎn)染后能顯著降低細胞中Mcl-1的蛋白表達水平，且細胞轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA后再加入TRAIL處理，細胞凋亡率明顯增加。結(jié)論 Mcl-1的高表達可能與HGC-27細胞對TRAIL抵抗有關(guān)，Mcl-1 siRNA沉默Mcl-1基因能增加HGC-27細胞對TRAIL的敏感性。

胃癌；細胞凋亡；小干擾RNA；Mcl-1

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族的成員，具有選擇性殺傷腫瘤細胞的特點，相比一般的化療藥物有其獨特的優(yōu)勢。TRAIL既可以通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡，又可以通過線粒體途徑使凋亡信號得以放大。Bcl-2家族是調(diào)控線粒體途徑的關(guān)鍵分子，其25個成員根據(jù)結(jié)構(gòu)及功能不同，分為促凋亡和抗凋亡蛋白，兩種力量之間的平衡決定了細胞是存活還是死亡。髓樣細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)屬于抗凋亡蛋白，最初在ML-1人髓樣白血病細胞系的分化中發(fā)現(xiàn)[1]。Mcl-1在多種腫瘤組織及細胞系中高表達，通過反義寡核苷酸或RNA干擾技術(shù)抑制Mcl-1的表達可以使腫瘤細胞對化療藥物變敏感[2-3]。該研究選擇對TRAIL不敏感的胃癌細胞HGC-27，采用siRNA技術(shù)特異性沉默Mcl-1基因，了解其對TRAIL誘導的細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 未分化的人胃癌細胞HGC-27(中國科學院上海細胞庫)；RPMI 1640培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；重組人可溶性TRAIL(美國Immunex公司)；碘化丙啶(PI)(美國Sigma-Aldrich公司)；廣譜的caspase抑制劑z-VAD-fmk(美國Calbiochem公司)；人Mcl-1 siRNA序列由上海吉瑪公司設(shè)計并合成； Lipofectamine 2000 Reagent(美國Invitrogen公司)；小鼠抗人Bcl-2、半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly[ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1)單克隆抗體和兔抗人Mcl-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗人Bcl-XL多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HGC-27細胞用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將HGC-27細胞接種于24孔板中，每孔1×105個細胞，次日細胞融合達80%以上，給予不同處理，每組設(shè)3個復孔。處理結(jié)束后分別收集上清液至流式管中，1 200 r/min離心10 min，棄上清液，孔中貼壁細胞加750 μl PI溶液(含50 mg/L PI、0.1%枸櫞酸鈉及0.1% Triton X-100)于37 ℃避光作用10～20 min，待孔內(nèi)細胞完全消化后也收集至對應(yīng)的流式管中，混勻，置于4 ℃避光染色過夜，次日上流式細胞儀(BD FACSVerse)檢測細胞凋亡，F(xiàn)CS Express 4軟件分析亞二倍體峰(sub-G1)所占的百分率即為細胞凋亡率。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達 分別收集不同處理的細胞，加入100 μl RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后4 ℃、14 000 r/min離心30 min，上清液即總蛋白；采用BCA法進行蛋白定量，每個樣品取20 μg進行SDS-PAGE；將分離開的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入不同的一抗(caspase-3、PARP-1、Bcl-2、Bcl-XL或Mcl-1抗體)，以GAPDH為內(nèi)參，4 ℃孵育過夜；次日用TBST洗3次，每次10 min，再加入不同的二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；最后用ECL法顯色，天能全自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染 Mcl-1 siRNA 正義鏈：5’-GUGCCUUUGUGGCUAAACA-3’，反義鏈：5’- UGUUUAGCCACAAAGGCAC-3’。實驗分為未轉(zhuǎn)染組(對照組)、轉(zhuǎn)染陰性對照(NC siRNA組)和轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA組，每組設(shè)3個復孔。轉(zhuǎn)染在6孔板及24孔板中進行，轉(zhuǎn)染前1 d接種細胞，使得轉(zhuǎn)染時細胞融合達30%。轉(zhuǎn)染前1 h將孔中培養(yǎng)基更換為無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基(6孔板每孔800 μl，24孔板每孔400 μl)。6孔板轉(zhuǎn)染分別用100 μl Opti-MEM稀釋100 pmol siRNA和5 μl Lipofectamine 2000 Reagent，二者混合后室溫放置20 min，最后將200 μl復合物滴入細胞中，4 h后換液，48 h后提取細胞總蛋白，采用Western blot法判斷基因沉默效果。24孔板轉(zhuǎn)染則分別用50 μl Opti-MEM稀釋20 pmol siRNA和1 μl Lipofectamine 2000 Reagent，二者混合后室溫放置20 min，最后將100 μl復合物滴入細胞中，4 h后換液，待細胞生長至約80%融合時，加入200 μg/L TRAIL繼續(xù)處理48 h，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 z-VAD-fmk能抑制TRAIL誘導的HGC-27細胞凋亡 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，HGC-27細胞對TRAIL不敏感，200 μg/L TRAIL處理48 h的細胞凋亡率僅為(20.65±3.23)%。z-VAD-fmk對細胞幾乎無毒性，而用z-VAD-fmk提前1 h預處理，再加入TRAIL繼續(xù)作用48 h時，細胞凋亡幾乎被完全阻止，凋亡率僅為(6.97±2.12)%(圖1)，與單用TRAIL組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.012，P<0.05)，說明TRAIL誘導HGC-27細胞發(fā)生的是caspase依賴性的細胞凋亡。

圖1 z-VAD-fmk能阻止TRAIL誘導的HGC-27細胞凋亡

A：對照組；B：TRAIL(200 μg/L)處理48 h；C：z-VAD-fmk(20 μmol/L)處理 48 h；D：z-VAD-fmk(20 μmol/L)先處理1 h，再加入 TRAIL(200 μg/L)繼續(xù)處理48 h；與TRAIL(200 μg/L)處理48 h比較：*P<0.05

2.2 TRAIL處理前后的caspase活化及抗凋亡蛋白的表達情況 caspase-3位于凋亡通路的末端，其激活可以切割多種細胞核蛋白及細胞骨架蛋白，引起凋亡的各種改變，其中最主要的底物是PARP-1。在TRAIL作用晚期cleaved-caspase-3和cleaved-PARP-1才出現(xiàn)，說明caspase活化很有限；而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1在TRAIL作用前后都沒有明顯的改變(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA能有效地降低細胞內(nèi)Mcl-1蛋白的表達水平 采用Lipofectamine 2000將Mcl-1 siRNA轉(zhuǎn)染進HGC-27細胞，Western blot法從蛋白水平驗證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，與對照組及NC siRNA組比較，Mcl-1 siRNA組幾乎檢測不到細胞中Mcl-1的蛋白(圖3)，說明基因沉默效果很好。

圖2 caspase-3、PARP-1、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1在TRAIL處理前后的表達

圖3 Mcl-1 siRNA敲除效果

2.4 轉(zhuǎn)染 Mcl-1 siRNA能增加HGC-27細胞對TRAIL的敏感性 在24孔板中轉(zhuǎn)染后，待細胞生長至約80%融合，加入TRAIL繼續(xù)處理，流式細胞術(shù)檢測顯示轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA可以明顯增加細胞凋亡率，48 h的凋亡率為(54.78±7.56)%，與NC siRNA組(20.65±3.95)%比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.927，P<0.05)。

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，盡管近年來手術(shù)治療和化療取得了很大的進展，患者的預后依然很差。TRAIL的優(yōu)勢在于其能選擇性殺傷腫瘤細胞，而不損傷正常細胞，因而被寄托了很大的希望，但是仍有許多腫瘤細胞對之不敏感，成為其應(yīng)用于臨床的重大障礙。在TRAIL誘導的細胞凋亡通路中，死亡受體途徑和線粒體途徑存在相互交叉，因而這兩條途徑中的任何一個環(huán)節(jié)都可能使得細胞對TRAIL發(fā)生抵抗，如細胞膜表面誘騙受體TRAIL-R3和TRAIL-R4的表達、cFLIP表達水平的升高、凋亡抑制蛋白家族的高表達或者抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的高表達等。早期研究[4]顯示許多細胞是因為高表達Bcl-2和Bcl-XL才導致其對TRAIL抵抗，而近幾年Mcl-1的抗凋亡作用越來越引起人們的注意。

Mcl-1的結(jié)構(gòu)與Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w等有很大的同源性，但也有其自身的特點。Mcl-1的羧基端有一個疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)區(qū)的BH2、BH1和BH3結(jié)構(gòu)域，其氨基端比其他抗凋亡蛋白更長，且含有兩個PEST(脯氨酸P/谷氨酸E/絲氨酸S/蘇氨酸T)基序，這可能是其半衰期短的原因，且這樣的結(jié)構(gòu)也是Mcl-1更新、定位、磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5]。Mcl-1主要定位在線粒體外膜上，阻止細胞色素c從線粒體釋放入胞質(zhì)。Mcl-1還能以很高的親和力與Bim、Bid及Puma結(jié)合，但是其對Noxa和Bak的選擇性更高。Mcl-1可以通過分離Bak，阻止Bak寡聚化，達到促生存的目的[6]。

Mcl-1基因在人類腫瘤中是高度擴增的基因之一[7]，在腫瘤發(fā)生中具有重要的作用。Mcl-1在多種腫瘤中高表達[8-9]，這可能是腫瘤細胞用來逃逸細胞死亡或者對化療藥物抵抗的機制[10]。目前已知去泛素酶USP9X能結(jié)合到Mcl-1上，去除容易被蛋白酶體降解的賴氨酸48-連接的多聚泛素鏈，從而穩(wěn)定Mcl-1的結(jié)構(gòu)[11]，促進腫瘤細胞的存活。Mcl-1蛋白在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃黏膜組織，并且與胃癌的T分期、臨床分期、轉(zhuǎn)移、血管浸潤以及5年生存率密切相關(guān)，同樣在胃癌細胞株中的表達水平明顯高于正常胃黏膜細胞[12]。本研究中，HGC-27細胞對TRAIL不敏感，48 h的凋亡率低于30%。細胞內(nèi)抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1都呈高表達，且TRAIL處理之后沒有明顯改變，這可能是導致HGC-27細胞對TRAIL抵抗的原因。

研究[13-14]顯示下調(diào)Mcl-1可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，目前下調(diào)Mcl-1的藥物主要有細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑和去泛素酶抑制劑。而反義寡核苷酸(ASO)和RNA干擾(RNAi)是體外實驗中常用的下調(diào)Mcl-1基因表達的方法。RNAi能把雙鏈siRNA引入細胞，通過特異性降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達。和ASO相比，其能抵御核酸酶降解，但siRNA有瞬時性，在體內(nèi)停留的時間較短。本研究用脂質(zhì)體法將Mcl-1特異性siRNA轉(zhuǎn)入HGC-27細胞，48 h后在蛋白水平檢測基因沉默效果，Mcl-1蛋白表達明顯降低，siRNA序列有效。隨即觀察轉(zhuǎn)染后對細胞凋亡的影響，結(jié)果 Mcl-1 siRNA能顯著增加TRAIL誘導的HGC-27細胞凋亡率，這進一步說明了Mcl-1在細胞內(nèi)的高表達是導致細胞對TRAIL耐受的因素。

綜上所述，本研究采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默Mcl-1基因，從而下調(diào)胃癌細胞HGC-27內(nèi)Mcl-1的表達，且下調(diào)Mcl-1后HGC-27細胞對TRAIL的敏感性增強。目前通過高通量篩選的辦法鑒定出多種Mcl-1的小分子抑制劑，其中選擇性抑制劑UMI-77可以通過與Mcl-1分子的BH3結(jié)合溝結(jié)合在前列腺癌細胞系及小鼠異種移植物模型中發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。Mcl-1目前作為腫瘤治療的新靶點受到了腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注，通過各種辦法抑制Mcl-1可能幫助克服腫瘤細胞化療藥物的抵抗。

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Effect of Mcl-1 siRNA on TRAIL-induced apoptosis in gastric cancer cells

Jin Wei1, Wu Ping2

(1Dept of Otolaryngology, Chaohu Hospital of Anhui Medical University, Chaohu 238000;2DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

Objective To explore the effect of Mcl-1 small interference RNA (siRNA) on tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis in gastric cancer HGC-27 cells. Methods The apoptotic rates of cells treated with TRAIL and pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk) alone or combination were measured by propidium iodide (PI) method using flow cytometry. The activation of caspase-3, cleavage of PARP-1, as well as the protein level of anti-apoptotic Bcl-2 proteins Bcl-2, Bcl-XLand Mcl-1 before and after TRAIL treatment were monitored by Western blot analysis. Transfection of Mcl-1 siRNA was performed using Lipofectamine 2000 reagent. The efficiency of gene silencing was quantified by Western blot and the effect of Mcl-1 siRNA on TRAIL-induced apoptosis was measured using PI method. Results HGC-27 cells were resistant to TRAIL-induced apoptosis, and z-VAD-fmk pretreatment could block apoptosis nearly completely. Activation of caspase-3 and cleavage of PARP-1 occurred in the late stage of apoptosis. The expression levels of Bcl-2, Bcl-XLand Mcl-1 were not altered after exposure to TRAIL. Transfection with Mcl-1 siRNA could obviously downregulate the expression level of Mcl-1 in HGC-27 cells and enhanced the sensitivity of cells to TRAIL-induced apoptosis. Conclusion Overexpression of Mcl-1 may account for the resistance of HGC-27 cells to TRAIL. Downregulation of Mcl-1 by siRNA can effectively enhance the sensitivity of HGC-27 cells to TRAIL-induced apoptosis.

gastric cancer; apoptosis; siRNA; Mcl-1

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.022.html

安徽高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2014A113)

1安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院耳鼻喉科，巢湖 238000

2安徽醫(yī)科大學免疫學教研室，合肥 230032

金 瑋，男，醫(yī)師；

吳 萍，女，講師，責任作者，E-mail：wuping@ahmu.edu.cn

R 735.2

A

1000-1492(2016)01-0047-05

2015-10-20接收