李小波,張 輝,王少濱,劉 杰,余 濤,杜怡斌,尹宗生

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促紅細(xì)胞生成素對(duì)脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的影響

李小波1,張 輝1,王少濱2,劉 杰1,余 濤1,杜怡斌1,尹宗生1

目的 探討成體大鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在促紅細(xì)胞生成素(EPO)的作用下體外分化的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，為成體脊髓源性NSCs移植治療脊髓損傷提供理論基礎(chǔ)。方法 利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，體外分離培養(yǎng)SD大鼠脊髓源性NSCs，隨后以含血清培養(yǎng)基貼壁誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d,行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以抗巢蛋白(Nestin)鑒定NSCs，以抗微管相關(guān)蛋白2(MAP2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色檢測(cè)NSCs的分化情況。選取第3代NSCs，向培養(yǎng)基中添加EPO, 使EPO的終濃度為10 IU/ml，并設(shè)不添加EPO的對(duì)照組，免疫熒光共聚焦顯微鏡下分別觀察并計(jì)數(shù)各組神經(jīng)元/細(xì)胞總數(shù)得出百分率。結(jié)果 SD大鼠脊髓組織體外懸浮培養(yǎng)可獲得大量神經(jīng)球，所獲得的神經(jīng)球均表達(dá)Nestin蛋白，以含血清培養(yǎng)基貼壁誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，可檢測(cè)出MAP2和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞；EPO組誘導(dǎo)分化后，表達(dá)MAP2陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)。結(jié)論 SD大鼠脊髓體外培養(yǎng)可獲得NSCs,EPO可促進(jìn)成體脊髓源性NSCs向神經(jīng)元方向分化。

神經(jīng)干細(xì)胞；促紅細(xì)胞生成素；神經(jīng)元；分化

脊髓損傷是骨科臨床工作中一種常見(jiàn)損傷，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步，其死亡率已經(jīng)明顯降低，但致殘率仍很高，主要原因是損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)目前醫(yī)學(xué)界仍沒(méi)有行之有效的治療措施。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是能夠自我更新、增殖和分化的一類細(xì)胞，有產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化潛能，在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷方面具有巨大的前景，應(yīng)用NSCs移植治療脊髓損傷也一直是當(dāng)前的主導(dǎo)研究方向，但研究[1]表明移植的NSCs生理狀態(tài)下神經(jīng)生發(fā)的比例很低,大部分會(huì)分化成為膠質(zhì)細(xì)胞形成瘢痕，阻礙損傷脊髓的恢復(fù)。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種水溶性的糖蛋白，可促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖、分化以及成熟。近來(lái)有研究[2]顯示EPO還可以降低神經(jīng)元對(duì)低氧缺血的敏感性，增強(qiáng)神經(jīng)元的存活能力等神經(jīng)保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)EPO調(diào)控大鼠脊髓源性NSCs分化方向的研究，為提高神經(jīng)生發(fā)比例探索新的途徑,為NSCs移植治療脊髓損傷提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠，SPF級(jí)，7～9 d齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基、B27、左旋多聚賴氨酸、左旋谷氨酸、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)均購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；大鼠抗巢蛋白(Nestin)抗體、小鼠抗微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein,MAP2)抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein,GFAP)抗體、山羊抗小鼠IgG/FITC、山羊抗兔IgG/TRITC均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；24孔板購(gòu)自美國(guó) Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓源性NSCs的體外培養(yǎng)和鑒定

1.2.1.1 NSCs的分離、培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[3]方法，7～9 d齡SD大鼠，以頸椎脫臼法處死，置于75%酒精中浸泡5 min消毒。消毒后在超凈臺(tái)內(nèi)剪開(kāi)背部皮膚，經(jīng)椎管剪開(kāi)，顯露脊髓組織；取出胸腰段脊髓，剝離組織表面的血管和脊膜，眼科剪剪碎至0.5 mm3大??；反復(fù)吹打后200目鋼網(wǎng)濾去組織雜質(zhì)，收集懸液，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液；沉淀用NSCs培養(yǎng)基重懸，以1×106/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d加入NSCs培養(yǎng)液，約7～9 d以機(jī)械吹打法傳代。

1.2.1.2 NSCs的Nestin免疫染色鑒定 參考文獻(xiàn)[4]方法，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，接種至24孔培養(yǎng)板中(預(yù)置有涂布100 μg /ml多聚賴氨酸的蓋玻片)，40 g/L多聚甲醛固定20 min,PBS 1 ml/孔，漂洗3次，5 min/次，0.5% Triton X-100破膜10 min，PBS 1 ml/孔，漂洗3次，5 min/次，10%山羊血清封閉后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，吸棄山羊血清，滴加小鼠抗Nestin(1 ∶200)一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS 1 ml/孔，漂洗3次，5 min/次，加入二抗山羊抗小鼠IgG /FITC (1 ∶100),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育1 h，PBS 1 ml/孔，漂洗3次，5 min/次，加入10 μg/ml Hoechst核染5 min，PBS 1 ml/孔，漂洗3次，5 min/次，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.1.3 神經(jīng)干細(xì)胞分化免疫化學(xué)染色 將NSCs接種于24孔培養(yǎng)板中(預(yù)置有涂布多聚賴氨酸的蓋玻片)，每孔平均接種30個(gè)神經(jīng)球，加入含有10%胎牛血清(FBS)的NSCs培養(yǎng)液500 μl， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，7 d后終止培養(yǎng)，收集貼有細(xì)胞的蓋玻片，分別做MAP-2、GFAP免疫熒光染色，免疫熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 EPO摻入實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取第3代NSCs懸液接種于添加EPO的無(wú)血清培養(yǎng)基中，使EPO的終濃度為10 IU/ml，另設(shè)不加EPO的對(duì)照組，37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待形成神經(jīng)球后，將EPO組和對(duì)照組分別接種于含10% FBS的分化培養(yǎng)基中，貼壁分化7 d。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2.2 MAP2免疫熒光染色 兩組NSCs貼壁分化7 d，分別行MAP2免疫熒光染色。然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組隨機(jī)取20個(gè)視野，計(jì)數(shù)MAP2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 NSCs鑒定

2.1.1 倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果 原代分離的NSCs呈單個(gè)懸浮狀，分散存在， 3～4 d后細(xì)胞逐漸聚集生長(zhǎng)形成體積大小不一、形狀不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán)(圖1A)，待培養(yǎng)至7～9 d，細(xì)胞團(tuán)逐漸增大至典型的球形 (圖1B)，部分體積較大細(xì)胞球的中心部位折光性差，顏色偏深，周邊邊境清晰，考慮可能為中心死亡細(xì)胞釋放毒性物質(zhì)及周邊細(xì)胞阻礙營(yíng)養(yǎng)吸收有關(guān)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，可用機(jī)械吹打法行細(xì)胞傳代。

2.1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代神經(jīng)球，Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核(圖2A)，并行Nestin抗體免疫化學(xué)染色，結(jié)果顯示Nestin蛋白在NSCs胞質(zhì)內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，神經(jīng)球被染成綠色(圖2B),提示細(xì)胞球?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞球。

圖1 NSCs培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài) ×200

圖2 NSCs的Nestin鑒定 ×200

貼壁分化培養(yǎng)7 d，普通光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)神經(jīng)球周緣細(xì)胞向外遷移，突起呈放射狀延伸(圖3A)，MAP2：免疫熒光顯微鏡下可見(jiàn)在部分細(xì)胞及突起中呈陽(yáng)性表達(dá)，被染成綠色(圖3B)，GFAP：免疫熒光顯微鏡下可見(jiàn)在部分細(xì)胞及突起中呈陽(yáng)性表達(dá)，被染成紅色(圖3C)。

2.2 EPO作用下MAP2免疫化學(xué)染色 貼壁分化7 d后，兩組NSCs分別行MAP2免疫化學(xué)染色，在熒光顯微鏡下，每組隨機(jī)取20個(gè)視野，計(jì)算神經(jīng)元分化比率，結(jié)果顯示對(duì)照組為(12.70±2.74)%，EPO組為(33.85±5.54)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.744，P<0.01)。見(jiàn)圖4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討了EPO對(duì)成體脊髓源性NSCs分化的調(diào)控作用，通過(guò)分離培養(yǎng)成體脊髓組織，體外成功獲得大量懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球。免疫化學(xué)染色顯示神經(jīng)球呈Nestin陽(yáng)性，而Nestin目前是公認(rèn)的NSCs標(biāo)志物[5]，表明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。在添加10%FBS的培養(yǎng)基中NSCs貼壁分化7 d后，行免疫組化染色顯示分化細(xì)胞中可見(jiàn)MAP2陽(yáng)性和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，表明成體脊髓源性NSCs體外培養(yǎng)，有分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。以上結(jié)果初步證實(shí)了從成體脊髓組織分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，具備了NSCs的基本屬性，為NSCs的定向分化和移植研究提供了良好應(yīng)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)材料。

圖3 NSCs分化

A：神經(jīng)球貼壁分化7 d(普通光鏡) ×200；B：神經(jīng)球貼壁分化7 d，免疫細(xì)胞化學(xué)示MAP2陽(yáng)性細(xì)胞(免疫熒光顯微鏡) ×200；C：神經(jīng)球貼壁分化7 d，免疫細(xì)胞化學(xué)示GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(免疫熒光顯微鏡) ×100

圖4 對(duì)照組和EPO組MAP2免疫化學(xué)染色 ×200

A：神經(jīng)元Hochest細(xì)胞核染色；B：神經(jīng)元MAP2染色；1：對(duì)照組；2：EPO組

自1992年Reynolds et al[6]首先報(bào)道培養(yǎng)獲得NSCs以來(lái)，NSCs在神經(jīng)損傷修復(fù)方面已經(jīng)取得了明顯的進(jìn)展，但相關(guān)研究主要集中在胚胎源性NSCs應(yīng)用于腦組織方面，而對(duì)于成體脊髓源性NSCs在脊髓組織的研究則相對(duì)較少[7]，從某種意義上來(lái)說(shuō)成體脊髓源性NSCs的臨床意義可能更大，因?yàn)樵谥袊?guó)神經(jīng)損傷更多發(fā)于成年人，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有截癱患者約40萬(wàn)，每年新增約1萬(wàn)患者，這些患者中大約有82%是16～32歲的青壯年男性。而且近來(lái)的研究[8]表明，神經(jīng)生發(fā)區(qū)如前腦室下帶和海馬齒狀回的亞顆粒帶等區(qū)域存在較多的NSCs，而在非神經(jīng)生發(fā)區(qū)如紋狀體、脊髓、小腦等雖然也存在NSCs，但數(shù)量很少，并且它們?cè)隗w內(nèi)主要生成膠質(zhì)細(xì)胞，而脊髓損傷的功能恢復(fù)主要依靠分化的神經(jīng)元重建神經(jīng)通路，但大量分化為膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)阻礙通路的重建，因此應(yīng)用成體脊髓源性NSCs修復(fù)神經(jīng)損傷，促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向定向分化，尤其是對(duì)NSCs發(fā)生與分化的調(diào)控因素及其調(diào)控機(jī)制的研究已逐漸成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。

EPO是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生成的體液因子，其主要的生理功能是促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生和分化進(jìn)而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成，近年來(lái)不斷有研究[9-10]表明EPO還有非促紅細(xì)胞生成的作用，主要表現(xiàn)抗炎癥、抗凋亡以及神經(jīng)保護(hù)等方面。其實(shí)EPO對(duì)體外培養(yǎng)的NSCs功能影響的實(shí)驗(yàn)研究并不新鮮，已有相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道EPO可抑制NSCs凋亡、促進(jìn)其增殖及向神經(jīng)元方向的定向分化，但目前的研究基本集中于胎鼠的腦組織，對(duì)成體脊髓源性NSCs研究甚少。本實(shí)驗(yàn)以此作為研究背景，采用成體脊髓源性NSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以10 IU/ml EPO作用于體外培養(yǎng)的NSCs，觀察NSCs的分化方向。結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，EPO組的NSCs向神經(jīng)元方向分化的比例顯著提高。不過(guò)對(duì)于EPO如何調(diào)控NSCs向神經(jīng)元方向分化卻鮮有文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，目前的研究[12-14]表明NSCs分化的調(diào)控機(jī)制主要與以下3個(gè)方面有關(guān)：微環(huán)境、基因和信號(hào)通路。本研究表明體外培養(yǎng)條件下EPO可以促進(jìn)成體脊髓源性NSCs向神經(jīng)元方向分化，可能的原因?yàn)镋PO與NSCs表面的EPO-R結(jié)合后誘導(dǎo)Jak2磷酸化，然后進(jìn)一步激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化方向。下一步將從信號(hào)通路方面深入探討EPO促進(jìn)脊髓源性NSCs向神經(jīng)元方向分化的機(jī)制。

綜上所述，成體大鼠脊髓組織體外分離培養(yǎng)可成功獲得能增殖、傳代并且有分化潛能的NSCs，EPO可促進(jìn)體外培養(yǎng)的成體脊髓源性NSCs向神經(jīng)元方向定向分化，為進(jìn)一步研究EPO促進(jìn)NSCs的分化機(jī)制及NSCs移植治療脊髓損傷等提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Li Xiaobo1, Zhang Hui1, Wang Shaobin2, et al

Effect of erythropoietin on the differentiation of adult spinal cord-derived neural stem cellsinvitro

(1Dept of Orthopaedics,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022;2DeptofOrthopaedics,TheFourthAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To investigate the promotion of the differentiation of erythropoietin(EPO) on the differentiation of the neural stem cells(NSCs)invitrofrom spinal cord of SD rats，and to provide experimental basis for the treatment of spinal cord injury by transplantating neural stem cells.Methods The spinal cord was isolated and cultured in serum-free suspension, then a differentiation suspension cultured in serum culture medium for 7 days was applied to the NSCs.Nestin was used to detect the NSCs,the differentiation ratio of NSCs into neurons and glia cells was detected by immunofluorescent histochemistry for microtubule-associated protein 2(MAP2) and glia fibrillary acid protein (GFAP).After obtained the third passage (P3) of NSCs, EPO was added to the medium on a final concentration of 10 IU/ml，control group without EPO, the differentiation proportion of MAP2-positive cells to total cells was identified by immunofluorescence staining.Results The results showed that the separated cells from spinal cord of SD rats formed neurospheres, in which nestin-positive cells were detected. GFAP and MAP2-positive cells were detected after differentiation culture.The proportion of MAP2-positive cells in the EPO group showed an significant increase compared with the control group(P<0.05).Conclusion The results indicate that NSCs can be obtained from the separated spinal cord of SD rats; EPO can increase the differentiation rate of NSCs into neurons.

neural stem cells;erythropoietin; neuron;differentiation

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.008.html

國(guó)家自然科學(xué)基金 (編號(hào)：81171173)

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

李小波，男，碩士研究生；

尹宗生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yinzongsheng1961@sina.com

R 651.21

A

1000-1492(2016)01-0014-04

2015-09-30接收