何鶯華，徐 濤，倪明明，黃 成，李 娟，孟曉明，李 俊

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穩(wěn)定表達(dá)NLRC5基因肝癌細(xì)胞株的建立

何鶯華1，徐 濤1，倪明明1，黃 成1，李 娟2，孟曉明1，李 俊1

目的 建立起能夠穩(wěn)定表達(dá)NLRC5基因的肝癌HepG2細(xì)胞株。方法 設(shè)計遺傳霉素(G418)的濃度梯度，通過對HepG2 細(xì)胞篩選最終確定篩選藥物濃度。將構(gòu)建好的人源pEGFP-C2-NLRC5重組質(zhì)粒利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至HepG2肝癌細(xì)胞株中，用G418篩選出耐藥陽性克隆。通過免疫熒光技術(shù)觀察綠色熒光蛋白穩(wěn)定表達(dá)情況，Western blot法驗證NLRC5蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 G418在14 d內(nèi)使HepG2細(xì)胞全部死亡的最小濃度是300 ng/ml。用G418篩選瞬轉(zhuǎn)pEGFP-C2-NLRC5 14 d在熒光顯微鏡下可見耐藥克隆的形成。Western blot法檢測顯示，穩(wěn)定過表達(dá)組NLRC5的蛋白水平比空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組高(t=15.356，P<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NLRC5基因的肝癌細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究NLRC5基因在肝癌的體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。

NLRC5;肝癌;穩(wěn)定細(xì)胞株;HepG2

肝細(xì)胞肝癌約占原發(fā)性肝癌的90%，已成為全世界最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在腫瘤相關(guān)死因中位列第三[1]。而肝癌的發(fā)生、發(fā)展主要與肝臟慢性炎癥等免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的肝細(xì)胞反復(fù)損傷與增生密切相關(guān)[2-3]，深入了解和掌握免疫反應(yīng)的分子機(jī)制將為今后治療與炎癥相關(guān)的癌癥提供幫助。天然免疫系統(tǒng)中的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding domain, leucine-rich repeat containing receptors,NLRs)家族成員之一，NLR家族含半胱天冬酶激活招募結(jié)構(gòu)域5(NOD-like receptor family CARD domain containing 5, NLRC5)蛋白分子，其在抗病毒免疫過程、炎癥小體形成以及主要組織相容性復(fù)合體-1(major histocompatibility complex- 1, MHC-I)分子基因轉(zhuǎn)錄過程中均有參與，但其具體的機(jī)制尚不能確定[4]。研究[5]顯示NLRC5在人肝星狀細(xì)胞(LX-2)中能正向調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)/Smad3通路介導(dǎo)白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)的分泌，提示NLRC5在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能有所參與。該研究建立能夠穩(wěn)定過表達(dá)NLRC5的HepG2細(xì)胞株，為研究NLRC5在肝癌中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞株HepG2由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物有限公司)；質(zhì)粒小抽試劑盒(美國AxyGen公司)；LB-Kana液體培養(yǎng)基由本實驗室配制；G418、LiprofectamineTM2000、Opti-MEM(美國Invitrogen公司)；PCR擴(kuò)增試劑盒、引物(上海生物工程有限公司)；一抗(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 人源重組真核表達(dá)載體pEGFP-C2-NLRC5質(zhì)粒抽提及鑒定 取微量pEGFP-C2和pEGFP-C2-NLRC5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)菌，將其涂布于LB-Kana瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃倒置過夜，第2天挑取單個菌落接種于8 ml LB-Kana液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min搖菌14 h。20%甘油保留1 ml菌液，其余菌液用小抽試劑盒抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性重組質(zhì)粒菌液。將陽性重組質(zhì)粒菌液擴(kuò)大搖菌后使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測定其濃度，-20 ℃保存。

1.2.2 確定G418篩選濃度 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化，計數(shù)板計數(shù)，12孔板中每孔接種1 000個細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，梯度加入G418，其濃度分別是100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 ng/ml， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1 d更換1640完全培養(yǎng)基1次，對每孔細(xì)胞生長情況多進(jìn)行觀察。篩選14 d后，觀察每孔細(xì)胞死亡情況，將全部殺死細(xì)胞的最小濃度確定為最終藥物篩選濃度。

1.2.3 人源pEGFP-C2-NLRC5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2 將HepG2細(xì)胞消化重懸接種至6孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞融合生長至70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將1 μg質(zhì)粒和5 μl LiprofectamineTM2000分別溶于250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，孵育5 min后將兩者混合，室溫靜置20 min。無菌PBS洗滌細(xì)胞2次后每孔加入1.5 ml Opti-MEM，再緩慢加入上述混合物，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后更換含1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并拍照，帶有綠色熒光的細(xì)胞即為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，經(jīng)G418篩選、單克隆后得到穩(wěn)定過表達(dá)組，實驗中同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

1.2.4 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染24 h后，以300 ng/ml的G418藥物濃度篩選，每隔1～2 d更換含有G418的完全培養(yǎng)基，約6 d細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，換用特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)。特殊培養(yǎng)基的制備方法：HepG2生長融合約達(dá)80 %，換液，培養(yǎng)過夜，收集培養(yǎng)基，濾器消毒，和新鮮培養(yǎng)基1 ∶1混合。待未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部被殺死后繼續(xù)篩選，轉(zhuǎn)染組可見耐藥克隆形成。將耐藥克隆消化，有限稀釋法稀釋至96孔板中，每孔1個細(xì)胞，用特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)加藥篩選，30 d后在熒光顯微鏡下選取陽性孔，接種至新的培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)期間保持300 ng/ml的G418藥物濃度，1周后進(jìn)行鑒定。

1.2.5 Western blot法檢測穩(wěn)定過表達(dá)組NLRC5的蛋白表達(dá) 取穩(wěn)定過表達(dá)組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，兩組細(xì)胞數(shù)相同，使用RIPA強裂解液(含1%的蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，加蛋白上樣緩沖液，100 ℃、10 min后收好蛋白保存至-20 ℃。配8% SDS-PAGE凝膠，加25 μl蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，TBST洗膜后，一抗孵育。次日TBST洗膜，在5%脫脂奶粉中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光劑，電腦顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒小抽后鑒定 將搖菌后的菌液按小抽試劑盒說明書抽提質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，與DNA Marker比對，發(fā)現(xiàn)第5組質(zhì)粒沒有在大小符合的位置出現(xiàn)條帶，說明這組單克隆菌液中并不含重組載體，應(yīng)該丟棄。見圖1。

圖1 RT-PCR鑒定質(zhì)粒小抽

M:Marker; 1：挑取的1號單克?。?：挑取的2號單克??；3：挑取的3號單克??；4：挑取的4號單克??；5：挑取的5號單克隆；6：挑取的6號單克隆

2.2 顯微鏡下觀察確定G418 篩選藥物濃度 接種HepG2細(xì)胞的12孔板，經(jīng)不同濃度G418篩選14 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞的死亡情況，發(fā)現(xiàn)300 ng/ml以及比其濃度更高的G418濃度可將細(xì)胞全部殺死，最終確定G418篩選濃度為300 ng/ml。見圖2。

圖2 G418不同濃度篩選14 d后HepG2細(xì)胞結(jié)果 ×100

A：100 ng/ml；B：200 ng/ml；C：300 ng/ml；D：400 ng/ml；E：500 ng/ml；F：600 ng/ml

2.3 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選情況 細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，因重組質(zhì)粒攜帶GFP綠色熒光基因以及 Neomysin 抗性基因，若質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，則在熒光倒置顯微鏡中可觀察到綠色熒光并能夠在G418 篩選壓力下存活。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染后24 h，熒光顯微鏡下可見綠色熒光細(xì)胞團(tuán)；G418 持續(xù)篩選14 d后，單克隆化的細(xì)胞耐藥群形成。

圖3 熒光顯微鏡下觀察NLRC5蛋白表達(dá) ×200

2.4 穩(wěn)定細(xì)胞株中NLRC5蛋白的表達(dá) Western blot法檢測結(jié)果顯示，穩(wěn)定過表達(dá)組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞內(nèi)均有NLRC5蛋白表達(dá)，穩(wěn)定過表達(dá)組NLRC5蛋白表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.356，P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blot法檢測NLRC5蛋白表達(dá)

1：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；2：穩(wěn)定表達(dá)組；與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較：*P<0.05

3 討論

NLRs是細(xì)胞內(nèi)模式識別受體家族，該家族包括5個亞家族，其中在人類至少發(fā)現(xiàn)了23個成員，在鼠中至少發(fā)現(xiàn)了34個成員。 這些成員通常含有3個結(jié)構(gòu)區(qū)域: 碳端為亮氨酸重復(fù)區(qū)域，能夠識別相應(yīng)的配體；中部區(qū)域為中心核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在NLRs與核苷酸鏈的結(jié)合以及自我聚合方面具有重要作用[6]。NLRs的氨基端為半胱天冬酶激活招募結(jié)構(gòu)域、熱蛋白結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合下游效應(yīng)分子從而激活NLRs，故這個區(qū)域稱為功能結(jié)構(gòu)域。近期新發(fā)現(xiàn)的NLRC5是NLRs家族中的一員，其基因定位于人類基因組的16q13，基因全長約96 000 bp[7]，編碼蛋白由1 866個氨基酸分子組成，是所有NLRs家族中分子量最大的一個成員。研究[8]顯示，NLRC5在人類及小鼠的多種組織中都能表達(dá)，造血細(xì)胞中具有較高的表達(dá)量，人體和小鼠骨髓、淋巴結(jié)、胸腺和脾這些免疫組織具有高表達(dá)量的mRNA[8-10]。

NLRC5被證明能夠參與到多種免疫反應(yīng)，但其在免疫調(diào)節(jié)過程中具體扮演什么角色還具有爭議性。Cui et al[11]研究發(fā)現(xiàn)NLRC5負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB途徑以及I型干擾素信號發(fā)生途徑。Tong et al[12]發(fā)現(xiàn)NLRC5基因缺陷性小鼠在受到水皰性口炎病毒感染后，體內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)的NF-κB以及I型干擾素信號途徑得到了加強。Neerincx et al[9]發(fā)現(xiàn)切除NLRC5基因的人單核細(xì)胞(THP-1)以及人真皮成纖維細(xì)胞受到Sendai病毒及聚胞嘧啶核苷酸感染后，胞內(nèi)I型干擾素表達(dá)量會降低，認(rèn)為NLRC5是I型干擾素產(chǎn)生途徑中的一個正向調(diào)節(jié)子。最近研究[5]顯示NLRC5在LX-2細(xì)胞中正向調(diào)節(jié)NF-κB/Smad3通路介導(dǎo)IL-6和IL-1β的分泌。有關(guān)NLRC5在免疫反應(yīng)中的作用的研究很多，但其在炎癥小體的形成過程中所起的激活作用尚不明確。然而慢性炎癥終歸是導(dǎo)致癌癥的主要原因之一，發(fā)展免疫療法也成為治療癌癥的理想靶點分子[13]。

脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染中，外源性基因片段整合到基因組的概率非常低，主要以染色體外的形式存在，并且不能隨細(xì)胞分裂一同復(fù)制，常用于24～72 h內(nèi)就進(jìn)行處理分析結(jié)果的實驗中。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相對于瞬時轉(zhuǎn)染而言，其進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒能整合入基因組中，隨細(xì)胞的分裂一同復(fù)制。但穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并不是不同于瞬時轉(zhuǎn)染的方法，只是對瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定整合的細(xì)胞株。通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NLRC5的細(xì)胞株可以大大降低轉(zhuǎn)染該基因的頻率，降低成本，方便實驗研究。并且在后續(xù)動物實驗中，需要向動物體內(nèi)注射表達(dá)有外源片段的細(xì)胞，需要構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，以防止注射入動物體內(nèi)后，外援片段很快丟失。

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Construction of stable a human hepatoma cell line HepG2 with over-expression of NLRC5

He Yinghua, Xu Tao, Ni Mingming, et al

(School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032)

Objective To establish a human hepatoma cell line HepG2 with over-expression of NLRC5. Methods Identified the suitable G418 concentration in the selection of stable transfection HepG2 cell. The eukaryotic expression plasmid pEGFP-C2-NLRC5 was transfected into the HepG2 cells mediated by lipofectamine and then selected with G418. Immunofluorescence assay and Western blot were used to analyze the expression of NLRC5. Results HepG2 cells were killed by G418 after 14 days with the minimum concentration of 300 ng/μl. Drug-resistant clones were formed after 14 days by selecting with G418. In the protein level, pEGFP-C2-NLRC5 HepG2 cell line was higher expression than pEGFP-C2 HepG2 cell line, the difference was statistically significant. Conclusion A hepatoma stable cell line over-expressing NLRC5 is successfully established, which may provide critical foundation for functional research of NLRC5 in liver cancer.

NLRC5; liver cancer; stable cell line; HepG2

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.004.html

國家自然科學(xué)基金(編號：81473268、81202978)；安徽省自然科學(xué)基金(編號：1308085MH145)

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

2合肥瑤海區(qū)長淮街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，合肥 230011

何鶯華，女，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: lj@ahmu.edu.cn

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0005-04

2015-10-20接收