黃磊 傅庭煥 李林 許文 譚向龍 聶為民 周先志 貌盼勇

100853 北京，解放軍醫(yī)學(xué)院(黃磊、譚向龍、貌盼勇)；100039 北京，解放軍第三○二醫(yī)院(黃磊、聶為民、周先志、貌盼勇)；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院(傅庭煥)；100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(李林)

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·論著·

LPS和R848對(duì)Tfh細(xì)胞表達(dá)Ki67和BcL6以及CXCR5的影響

黃磊 傅庭煥 李林 許文 譚向龍 聶為民 周先志 貌盼勇

100853 北京，解放軍醫(yī)學(xué)院(黃磊、譚向龍、貌盼勇)；100039 北京，解放軍第三○二醫(yī)院(黃磊、聶為民、周先志、貌盼勇)；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院(傅庭煥)；100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(李林)

目的 評(píng)估HIV感染及感染后微生物易位對(duì)濾泡輔助T淋巴細(xì)胞(T follicular helper cells，Tfh)功能的影響。方法 選取非HIV感染者外周淺表淋巴結(jié)(Lymph nodes,LNs)，分離淋巴細(xì)胞，在存在或不存在HIV感染情況下，分別以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和R848刺激；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tfh細(xì)胞表達(dá)Ki67、BcL6和CXCR5情況。結(jié)果 LPS和R848刺激可促使Tfh細(xì)胞擴(kuò)張并高表達(dá)BcL6，與LPS比，R848起效晚，但效果更強(qiáng)。雖然LPS可協(xié)助HIV抑制Tfh細(xì)胞表達(dá)BcL6，但HIV-1可能才是Tfh細(xì)胞下調(diào)BcL6表達(dá)的根本原因。此外，LPS和R848刺激可導(dǎo)致Tfh細(xì)胞下調(diào)CXCR5表達(dá)，使Tfh細(xì)胞接受CXCL13趨化定位的能力降低。結(jié)論 HIV感染是導(dǎo)致Tfh細(xì)胞功能異常的根本原因，但消化道微生物產(chǎn)物的漏入可能在感染后Tfh細(xì)胞功能異常中，起到了協(xié)同增效作用。因此，抑制感染后微生物產(chǎn)物易位，可能改善感染者體液免疫功能。

濾泡輔助T淋巴細(xì)胞(T follicular helper cells, Tfh)是一個(gè)特殊的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，定居在淋巴結(jié)(lymph nodes, LNs)的B細(xì)胞淋巴濾泡中，對(duì)生發(fā)中心(germinal center, GC)抗原特異性B細(xì)胞的生存、增生、分化以及抗體類(lèi)型轉(zhuǎn)換起著關(guān)鍵性的輔助作用[1]。因此，Tfh細(xì)胞的正常功能對(duì)于疫苗的設(shè)計(jì)非常重要。同時(shí)，Tfh細(xì)胞也在自身免疫性疾病中，扮演著重要角色[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)， Tfh細(xì)胞對(duì)HIV非常易感，但其數(shù)量并沒(méi)有因?yàn)楦腥径鴾p少，反而增加了[3]。HIV感染后Tfh的異?？赡軐?dǎo)致了體液免疫受損。研究發(fā)現(xiàn)其數(shù)量與GC中B細(xì)胞的數(shù)量正相關(guān)，但與記憶性B細(xì)胞負(fù)相關(guān)[3]。HIV感染導(dǎo)致消化道免疫和物理屏障受損，消化道微生物產(chǎn)物大量入血[4]。但是，目前對(duì)微生物產(chǎn)物易位是否會(huì)導(dǎo)致Tfh細(xì)胞的擴(kuò)張和功能改變?nèi)圆磺宄?。脂多?lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，而R848是一種模擬源性病毒的單鏈 RNA 分子。為了闡述慢性HIV感染中，病原微生物產(chǎn)物對(duì)Tfh的影響，我們從非HIV感染者外周淺表LNs中分離淋巴細(xì)胞，以LPS、R848刺激或HIV-1感染加LPS、R848刺激作用于淋巴細(xì)胞，并檢測(cè)Tfh細(xì)胞表達(dá)Ki67、CXCR5及BCL6的改變，以期為理解HIV感染中Tfh細(xì)胞功能及體液免疫的改變有所幫助。

1 材料與方法

1.1 患者和組織標(biāo)本 解放軍第302醫(yī)院及解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院2013至2015年就診患者中，留取因外周淺表LNs腫大行活檢的非HIV感染者的LNs。將LNs分為兩部分，一部分4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，另一部分用于分離淋巴細(xì)胞。石蠟包埋的LNs經(jīng)常規(guī)切片，HE染色后，選取其中經(jīng)臨床和病理證實(shí)排除腫瘤和感染的病例20例(頸部2例、腋窩3例，腹股溝15例)，將分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。患者中位年齡為34歲(16歲-49歲)，其中男性12例、女性8例。常規(guī)手術(shù)留取LNs前均簽訂知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 LNs中淋巴細(xì)胞的分離 常規(guī)手術(shù)方法取LNs后，將其四分之三部分放于孔徑150 μm 的細(xì)胞篩網(wǎng)上，用常規(guī)方法研磨、分離淋巴細(xì)胞[5]。

1.3 HIV-1(X4嗜性)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 HIV-1(X4嗜性)質(zhì)粒為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)。將293T細(xì)胞(約5×107個(gè))按1∶4體積比加入RPMI-1640培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)皿(直徑10 cm)中，總體積20 ml。次日，按上述體系再傳代1次。隨后將HIV-1(X4嗜性)質(zhì)粒(相當(dāng)24 μg的DNA)加入1.5 ml Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基中，混勻后，將60 5 μl的 lipofectamine TM 2000加入其中，孵育5 min?；旌舷♂尩馁|(zhì)粒DNA和lipofectamine TM 2000，輕搖并室溫孵育20 min。隨后將混合物加入到293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中混勻，37 ℃的CO2孵育箱孵育48 h，收取上清。

1.4 淋巴細(xì)胞的刺激 將新鮮分離的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)后，立即接種在6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。分別加入LPS(20 ng/ml)和R848(1 μg/ml)。每種刺激劑各兩孔，分別培養(yǎng)5 d和8 d后，加入胰蛋白酶消化后，重新用PBS懸浮，留待下一步流式細(xì)胞染色用。以上實(shí)驗(yàn)共使用LNs10枚。

HIV-1(X4嗜性)感染淋巴細(xì)胞基本實(shí)驗(yàn)步驟同上。鑒于HIV-1感染所導(dǎo)致的細(xì)胞損失，每孔加入3.5×105個(gè)細(xì)胞。分為HIV組、HIV+LPS組和HIV+R848組。每組各兩孔，分別培養(yǎng)5 d和8 d。HIV-1(X4嗜性)DNA濃度為150 ng/ml。以上實(shí)驗(yàn)共使用LNs10枚。每組均以不加任何刺激劑、培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間的淋巴細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5 流式細(xì)胞檢測(cè) 將刺激或感染后的淋巴細(xì)胞重新懸浮于PBS中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，保證細(xì)胞濃度>2.5×105/ml，取200 μl細(xì)胞懸液置于流式管中，根據(jù)不同染色方案，常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞表面抗CD3、抗CD8、抗CD45RO、抗CXCR5、抗PD1染色后，加入200 μl PBS重懸，以穿膜試劑盒(eBioscience公司)按操作說(shuō)明進(jìn)行穿膜，加入抗Ki67、抗BcL6流式抗體染色后，立即上流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司 FACScanto型)。因HIV-1感染會(huì)導(dǎo)致CD4下調(diào)， 以CD3+CD8-代表CD4+T淋巴細(xì)胞，故Tfh細(xì)胞圈門(mén)策略為CD3+CD8-CD45RO+, CXCR5+PD1+(圖1)。

a 圈出淋巴細(xì)胞，b 以CD3陽(yáng)性，CD8陰性定義CD4+T淋巴細(xì)胞，c 從CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步選出CD45RO+CD4+T淋巴細(xì)胞，d 選出前者中CXCR5+PD1+細(xì)胞，即為T(mén)fh細(xì)胞。圖1 Tfh細(xì)胞圈門(mén)策略a Gatng lymphocytes, b Defining CD4+T Cells as CD3+CD8- cells from lymphocytes, c Choosing CD45RO+ cells from the former, d Gating CXCR5+PD1+ from the former as Tfh cellsFig.1 Gate strategy of Tfh

a 刺激5 d后Tfh表達(dá)Ki67的變化，b 刺激8 d后Tfh表達(dá)Ki67的變化圖2 LPS和R848對(duì)Tfh細(xì)胞增生的影響a The alteration of Ki67 expression in Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of Ki67 expression in Tfh after 8 days of stimulationFig.2 Contribution of LPS and R848 to proliferation of Tfh

2 結(jié)果

2.1 LPS和R848的刺激對(duì)Tfh細(xì)胞增生的影響 Ki67是一個(gè)細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。為了LPS和R848對(duì)Tfh細(xì)胞增生的影響，我們檢測(cè)了被LPS和R848刺激5 d、8 d后，LNs分離淋巴細(xì)胞中Tfh細(xì)胞表達(dá)Ki67的情況。結(jié)果顯示，第5天時(shí)，LPS刺激組Tfh表達(dá)Ki67水平(21.9±3.97)明顯升高，與對(duì)照組(7.16±1.89)和R848組(9.16±3.19)組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而R848刺激組表達(dá)水平雖較對(duì)照組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.497)；在第8天時(shí)，LPS組(21.15±5.18)和R848組(36.6±3.62)Tfh表達(dá)Ki67水平均顯著升高，與對(duì)照組(12.56±2.83)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，R848組表達(dá)水平也較LPS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

2.2 LPS和R848的刺激對(duì)Tfh細(xì)胞表達(dá)BcL6的影響 第5天時(shí)，LPS組(67.98±10.7)和R848組(60.53±6.7)Tfh細(xì)胞BcL6表達(dá)水平顯著升高，與對(duì)照組(43.28±6.82)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與R848組比，LPS組表達(dá)更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.17)；第8天， R848組(89.43±6.83)BcL6表達(dá)升高最顯著，與對(duì)照組(52.33±7.94)和LPS組(60.63±7.93)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，雖然LPS組比對(duì)照組表達(dá)水平高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)(圖3)。

a 單純刺激5天后Tfh表達(dá)BcL6的變化，b 單純刺激8 d后Tfh表達(dá)BcL6的變化，c 感染并刺激5 d后Tfh表達(dá)BcL6的變化，d 感染并刺激8 d后Tfh表達(dá)BcL6的變化圖3 HIV-1、LPS和R848對(duì)Tfh細(xì)胞BcL6表達(dá)的影響a The alteration of BcL6 expression in Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of Bcl6 expression in Tfh after 8 days of stimulation. c The alteration of BcL6 expression in Tfh after 5 days of stimulation along with infection. d The alteration of Bcl6 expression in Tfh after 8 days of stimulation along with infectionFig.3 Contribution of HIV-1, LPS and R848 to BcL6 expression of Tfh

2.3 HIV-1感染及LPS和R848的協(xié)同作用對(duì)Tfh細(xì)胞表達(dá)BcL6的影響 用HIV-1X4嗜性病毒株感染LNs分離的淋巴細(xì)胞，同時(shí)給予LPS或R848刺激，結(jié)果表明：無(wú)論是在第5天(30.66±6.11)或是第8天(32.85±4.73)，HIV-1單純感染組Tfh細(xì)胞的BcL6表達(dá)，與對(duì)照組(分別為48.67±6.29，53.99±6.31)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與單純LPS刺激相反，HIV-1+LPS組均顯著降低了Tfh細(xì)胞BcL6的表達(dá)，但僅在第5天時(shí)(15.02±5.07)與HIV-1單純感染組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，8 d時(shí)(25.2±7.21)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.128)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；刺激5 d和8 d后，HIV-1+R848組的Tfh細(xì)胞BCL6的表達(dá)與對(duì)照組比均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與單純HIV-1感染組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0)，與HIV-1+LPS組相比僅刺激5 d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

a 刺激5 d后Tfh表達(dá)CXCR5的變化，b 刺激8 d后Tfh表達(dá)CXCR5的變化圖4 LPS和R848對(duì)Tfh細(xì)胞CXCR5表達(dá)的影響a The alteration of CXCR5 expression on Tfh after 5 days of stimulation. b The alteration of CXCR5 expression on Tfh after 8 days of stimulationFig.4 Contribution of LPS and R848 to CXCR5 expression of Tfh

2.4 LPS和R848的刺激對(duì)Tfh細(xì)胞表達(dá)CXCR5的影響 刺激后第5天，LPS組(153.3±34.43)和R848組(133.51±19.97)的Tfh細(xì)胞CXCR5表達(dá)水平下降，與對(duì)照組(751.49±62.66)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LPS組與R848組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.933)；刺激后第8天與刺激5 d相似，LPS組(166.42±52.88)和R848組(184.02±43.77)CXCR5表達(dá)下降，與對(duì)照組(829.28±48.95)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LPS組與R848組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0)(圖4)。

3 討論

抗體可通過(guò)多種機(jī)制阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，清除感染細(xì)胞，在抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用。然而，HIV卻進(jìn)化出一套精密的機(jī)制逃避中和抗體反應(yīng)，繼而導(dǎo)致感染慢性化[6]。同時(shí)，HIV還可影響抗體反應(yīng)的質(zhì)量，表現(xiàn)為慢性HIV感染中的高γ球蛋白血癥，對(duì)蛋白疫苗反應(yīng)能力下降，和抗原特異性記憶B細(xì)胞減少[7]。近期的一些研究發(fā)現(xiàn)慢性HIV感染中， Tfh細(xì)胞在HIV感染者淋巴濾泡中的聚集，以及功能改變可能是HIV逃脫體液免疫的基礎(chǔ)[3]。

B細(xì)胞接受同源Tfh細(xì)胞的輔助后，經(jīng)兩條不同的途徑分化為分泌抗體細(xì)胞。濾泡外途徑主要產(chǎn)生短壽命、低親和力漿細(xì)胞。而濾泡內(nèi)途徑主要發(fā)生在GC，在此進(jìn)行抗體親和力突變反應(yīng)，獲得選擇性競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞在Tfh細(xì)胞的輔助下，最終分化為長(zhǎng)壽命記憶性B細(xì)胞或記憶性漿細(xì)胞[8]。根據(jù)BCL6表達(dá)水平，Tfh細(xì)胞可以分為兩個(gè)亞群，低表達(dá)BCL6的Tfh細(xì)胞，通常被稱(chēng)為前體Tfh細(xì)胞，和高表達(dá)BCL6的GC Tfh細(xì)胞。前體Tfh細(xì)胞主要定居于濾泡或毗鄰濾泡的區(qū)域，僅為B細(xì)胞能提濾泡外輔助，而GC Tfh細(xì)胞定居于GC內(nèi)，對(duì)于GC的發(fā)育和B細(xì)胞的選擇至關(guān)重要[9，10]。與前體Tfh細(xì)胞相比，GC Tfh細(xì)胞表達(dá)更高的CXCR5、PD1、ICOS和CXCL13，分泌更多的IL-21。BcL6是Tfh細(xì)胞分化的主要調(diào)控者，可通過(guò)拮抗Blimp-1促使CD4+T淋巴細(xì)胞向Tfh細(xì)胞方向分化[11]。CXCR5是CXCL13的配體，可以表達(dá)于Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞表面。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然LPS和R848刺激可以促進(jìn)Tfh細(xì)胞的擴(kuò)張，上調(diào)Tfh細(xì)胞BcL6的表達(dá)，但是在非HIV-1感染條件下這些刺激卻導(dǎo)致了CXCR5下降，這意味著Tfh細(xì)胞接受CXCL13趨化定位于淋巴濾泡中的能力降低。同時(shí),HIV-1感染可以抑制Tfh細(xì)胞表達(dá)BcL6，而LPS在HIV-1感染條件下可以增強(qiáng)這種效應(yīng)，因此可協(xié)同HIV-1下調(diào)BcL6表達(dá)。此外，根據(jù)刺激5 d和刺激8 d時(shí)Ki67和BcL6表達(dá)情況，表明R848對(duì)Tfh細(xì)胞的刺激作用較LPS起效晚，但作用效果更強(qiáng)。上述結(jié)果提示，在HIV-1感染條件下，微生物產(chǎn)物所導(dǎo)致的Tfh細(xì)胞的擴(kuò)張，但并沒(méi)有催生大量GC Tfh細(xì)胞的產(chǎn)生，而是誘導(dǎo)非GC Tfh細(xì)胞擴(kuò)張。這種擴(kuò)張的最終結(jié)果導(dǎo)致了體液免疫的質(zhì)量下降。

總之，我們的研究結(jié)果提示，HIV感染后消化道微生物產(chǎn)物的漏入可能刺激了Tfh細(xì)胞的擴(kuò)張，但同時(shí)導(dǎo)致了其功能的受損，HIV本身可能是導(dǎo)致Tfh細(xì)胞功能異常的根本原因。因此，抑制感染后大量微生物產(chǎn)物的易位，可能改善感染者體液免疫功能。

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Impact of LPS and R848 stimulating to Ki67, BcL6 and CXCR5 expression of T follicular helper cells

HuangLei,FuTinghuan,LiLin,XuWen，TanXianglong,NieWeimin,ZhouXianzhi,MaoPanyong

MedicalschoolofChinesePLA,Beijing100853,China(HuangL,TanXL,MaoPY);PLA302Hospital,Beijing100039,China(HuangL,NieWM,ZhouXZ,MaoPY);FirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital,Beijing100048,China(FuTH)；AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100071，China(LiL)

ZhouXianzhi,Email:zxz.302@163.com；MaoPanyong,Email:maopy302@163.com

Objective To evaluate the possible impact of HIV infection and microbic products on the function of T follicular helper cells(Tfh). Methods Lymph nodes of non-HIV infected individuals were recruited, and then ground gently and isolated into single lymphocytes. Ki67, BcL6 and CXCR5 expressions of Tfh were determined by flow cytometry after stimulation of lipopolysaccharide(LPS) and R848, or along with HIV-1 infection, respectively. Results The stimulation of LPS and R848 induced the expansion and BcL6 expression of Tfh. These effects of R848 started late but were stronger comparing to LPS. HIV-1 was intrinsic reason which downregulated the expression of BcL6 in Tfh, but LPS played a synergetic role in that. Moreover, the stimulation of LPS and R848 also downregulated the expression of CXCR5 in Tfh surface, which could impeded the ability of Tfh locating in lymphoid follicle. Conclusions HIV is the intrinsic reason which results in the abnormal function of Tfh, but the translocation of microbic products play a synergetic role. Therefore, inhibiting the translocation of microbic products could improve the adaptive immunity of host.

Aequired immunodeficiency syndromes; Acquired immunodeficiency syndrome; T follicular helper cells; lymph nodes; lipopolysaccharide

周先志，Email：zxz.302@163.com；貌盼勇，Email: maopy302@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.005

獲得免疫缺陷綜合征；艾滋??；濾泡輔助T淋巴細(xì)胞；淋巴結(jié)；脂多糖

2016-03-21)