谷雅君 佘鈿田 付紅偉 秦偉 王毅超 劉運德

300203 天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院(谷雅君、佘鈿田、付紅偉、王毅超、劉運德);300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗中心(付紅偉)，普通外科(秦偉)

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·綜述·

FDA緊急使用授權(quán)的埃博拉檢測技術(shù)的評估比較

谷雅君 佘鈿田 付紅偉 秦偉 王毅超 劉運德

300203 天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院(谷雅君、佘鈿田、付紅偉、王毅超、劉運德);300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗中心(付紅偉)，普通外科(秦偉)

埃博拉病毒 (Ebolavirus, EBOV) 是引起人類及其他哺乳動物埃博拉出血熱的病原體，由于死亡率高達(dá)70%-90%，疾病的早期診斷與及時治療顯得尤為重要。迄今為止，F(xiàn)DA授權(quán)了11項緊急使用的EBOV檢測方法，主要分為依賴rRT-PCR的病毒核酸檢測和基于抗原抗體反應(yīng)的病毒抗原檢測兩大類；其中前者是實驗室檢測EBOV感染最敏感的方法，主要包括EZ1、NP、VP40、NGDS BT-E、Biothreat-E、RealStar、LightMix以及Cepheid Xpert試驗；而基于病毒抗原的檢測，如Corgenix ReEBOV和OraQuick更加快速且無需依賴任何特殊儀器設(shè)備，適用于床旁和現(xiàn)場檢測。如何建立適用于多種標(biāo)本類型的檢測方法，更加快速特異地進(jìn)行檢測分型，將是未來發(fā)展EBOV檢測平臺的重要發(fā)展方向。

Fund programs: Tianjin City High School Science & Technology Fund Planning Project (20140124); Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (15JCQNJC11600;15JCYBJC27400)

埃博拉病毒 (Ebolavirus, EBOV) 屬絲狀病毒科絲狀病毒屬、單股負(fù)鏈RNA病毒，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由RNA和衣殼蛋白組成，呈長絲狀體。病毒基因組被包裹在完全封閉的核衣殼外殼中，長約18.9 kb，主要編碼七種蛋白質(zhì) (圖1)：包膜刺突糖蛋白 (glycoprotein, GP)、核蛋白 (nucleoprotein, NP)、復(fù)制轉(zhuǎn)錄蛋白VP30、聚合酶輔助因子VP35、基質(zhì)蛋白VP40、基質(zhì)蛋白VP24和 RNA依賴性RNA 聚合酶L組成[1-4]。

圖1 埃博拉病毒的基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Genome structure of Ebola virus

EBOV是一種能夠引起人類和靈長類動物產(chǎn)生急性出血熱傳染病的病原體，主要通過接觸受感染的動物或人的血液和體液進(jìn)行傳播。1976年，EBOV疫情首次暴發(fā)于非洲剛果民主共和國 (前扎伊爾)，至今無治療特效藥，被列為生物安全第四等級病毒 (Biosafety Level 4，BSL 4)[5]，甚至高于HIV和SARS (BSL 3)。2014年，幾內(nèi)亞、利比里亞、塞拉利昂等非洲國家出現(xiàn)了EBOV疫情大暴發(fā)。據(jù)WHO報告，截止2016年3月16日，以上三個主要疫情國家共報告出現(xiàn)28 603例確診或疑似埃博拉出血熱病例[6]，因此如何建立簡便、快速的實驗室診斷方法是控制疫情傳播的重要手段。美國食品藥品管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 授權(quán)了數(shù)項埃緊急使用的博拉病毒檢測方法 (表1)，這些方法主要分為依賴實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (real-time reverse transcriptase PCR, rRT-PCR) 的病毒核酸檢測和基于抗原抗體反應(yīng)的病毒抗原檢測兩大類。

1 基于PCR的檢測技術(shù)

自2014年以來，美國FDA已緊急批準(zhǔn)了八項 PCR相關(guān)技術(shù)用于EBOV的檢測，分別是來源于美國國防部 (The U.S. Department of Defense, DoD) EZ1試驗、 美國疾病控制與預(yù)防中心 (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) NP和VP40試驗、BioFire Defense公司FilmArray NGDS BT-E 和Biothreat-E試驗、AltonaDiagostics公司RealStarFilov-irus 篩查試劑盒、羅氏公司的LightMix試驗以及Cepheid AB公司的Xpert試驗。雖然各方法商品化名稱各異，但該類方法工作原理和實驗流程大致相同。提取患者全血、血清、血漿或體液中的總RNA后，針對高度保守的NP或GP等編碼基因設(shè)計引物，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和實時PCR即rRT-qPCR的方法在發(fā)病一周內(nèi)即可檢測到病毒核酸。迄今為止，rRT-qPCR是實驗室檢測EBOV感染最敏感的技術(shù)。

Leski等[7]采用FilmArray Biothreat-E test在83例疑似EBOV感染患者的血液、咽拭子或尿液標(biāo)本中，檢測到6例陽性患者，且與CDC推薦的Ebola Virus NP Real-time RT-PCR Assay和 VP40 Real-time RT-PCR Assay陽性結(jié)果完全一致。配合FilmArray定制的快速、高精準(zhǔn)、易于操作的PCR分子診斷儀，F(xiàn)ilmArray Biothreat-E test可在1 h內(nèi)完成并提交EBOV檢測報告。Southern等[8]評估了FDA緊急授權(quán)的4種EBOV病毒檢測方法，包括CDC的NP 和 VP40Real-time RT-PCR Assay和生物梅里埃旗下BioFire公司的FilmArrayBiothreat-E test和BT-E panel。對于陰性對照和4×107至4×102TCID50/ml 間各滴度的人工摻入EBOV的全血標(biāo)本，F(xiàn)ilmArray和rRT-PCR檢出結(jié)果完全一致。而對于感染患者的臨床標(biāo)本，F(xiàn)ilmArray和rRT-PCR檢測全血和尿液的一致性均為85% (23/27, 11/13)。當(dāng)使用Filmarray檢測全血，而rRT-PCR檢測配對血漿時，其一致性達(dá)90%。FilmArray為那些缺乏大型PCR儀器的醫(yī)療機構(gòu)和公共衛(wèi)生實驗室開辟了一種新的EBOV檢測途徑。

雖然rRT-qPCR技術(shù)有著靈敏度高、特異性強、簡便快速等優(yōu)勢，但仍存在著一定的局限性[9]。第一，PCR 操作過程中的交叉污染可能會造成假陽性和非特異性擴增，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。第二，rRT-qPCR技術(shù)需要特殊儀器進(jìn)行核酸擴增，不適用于床旁和現(xiàn)場檢測。第三，盡管大多PCR方法基于EBOV基因組保守區(qū)NP或GP序列進(jìn)行擴增，但病毒基因序列仍存在高度突變[10]，常規(guī)引物可能出現(xiàn)不同程度的漏檢。Gire等[11]利用高通量組技術(shù)對2014年疫情暴發(fā)的78個患者的99個EBOV基因組進(jìn)行測序，與以往有記錄的EBOV相比，出現(xiàn) 341個固定堿基替換與 55 個單核苷酸多態(tài)性位點，提示了宿主內(nèi)和宿主間病毒基因組呈現(xiàn)一定程度的多態(tài)性。因此，如何針對所有可致病性亞型的EBOV對現(xiàn)有PCR方法進(jìn)行完善是科研人員的重要任務(wù)。

2 病毒抗原檢測技術(shù)

FDA緊急批準(zhǔn)的三項EBOV抗原快速檢測技術(shù)，分別是來源于Corgenix公司的ReEBOV Antigen Rapid Test和OraSure公司的兩項OraQuick Ebola Rapid Antigen Test。

美國Corgenix公司所開發(fā)的新型EBOV抗原快速檢測工具和早孕測試筆的工作原理相似，可以通過試紙條上的顏色變化，快速判斷出病毒的存在。如果待檢血液中含有EBOV，那么在檢測條上會有明顯的顏色變化顯示。Broadhurst等[12]收集了來源于塞拉利昂多家臨床醫(yī)學(xué)中心的連續(xù)EDTA靜脈血樣本進(jìn)行EBOV抗原快速檢測 (ReEBOV Antigen Rapid Test)和實時RT-PCR (RealStar Filovirus RT-PCR Kit, AltonaDiagostics) 檢測。在45份RT-PCR陽性的樣本中，快速檢測結(jié)果全部為陽性 (靈敏度100%，95% CI 92.1-100)；RT-PCR檢驗結(jié)果為陰性的232例樣本中，214份樣品快檢結(jié)果為陰性 (特異度92.2%，95% CI 88.0-95.3)。ReEBOV快檢試劑僅需一滴血即可進(jìn)行床旁檢測，該法在減少樣本體積的同時，降低了檢驗人員的感染風(fēng)險，縮短了疑似病例需要隔離的等待時間[13]。與ReEBOV Antigen Rapid Test相似，OraSure Technologies公司研發(fā)的OraQuick也是基于抗原抗體反應(yīng)的試紙條技術(shù)，其檢測時間短于rRT-PCR相關(guān)技術(shù)，操作步驟簡便易行。但快速診斷試劑盒敏感性有待提高，以期能夠在早期疫情爆發(fā)時檢測出EBOV[14]。

表1 已獲得FDA緊急使用授權(quán)的埃博拉病毒檢測方法 [15](按照獲批先后時間排序)

注：PFU, plaque-forming uint, 空斑形成單位;TCID, Tissue culture infective dose,半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量; Rxn, reaction, 反應(yīng))

[1] Jun SR, Leuze MR, Nookaew I, et al.Ebolavirus comparative genomics [J]. FEMS Microbiol Rev, 2015, 39(5):764-778. doi: 10.1093/femsre/fuv031.

[2] Licata JM, Johnson RF, Han Z, et al.Contribution of ebola virus glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles [J].J Virol, 2004, 78(14): 7344-7351. doi: 10.1128/JVI.78.14.7344-7351.2004.

[3] 秦恩強. 埃博拉病毒病的研究進(jìn)展 [J]. 中華現(xiàn)代護(hù)理雜志, 2014, 20(35): 4409-4410. doi:10.3760/j.issn.1674-2907.2014.35.001.

[4] 孫玉蘭，李德新. 埃博拉病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展 [J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2004, 18(4): 392-394. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2004.04.033.

[5] Watt A, Moukambi F, Banadyga L, et al. A novel life cycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 in virus infectivity [J]. J Virol, 2014, 88(18):10511-10524. doi: 10.1128/JVI.01272-14.

[6] World Health Organization. Ebola situationreport-16 MARCH 2016 (http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/204629/1/ebolasitrep_16Mar2016_eng.pdf?ua=1&ua=1).

[7] Leski TA, Ansumana R, Taitt CR, et al. Use of the FilmArray System for Detection of Zaire ebolavirus in a Small Hospital in Bo, Sierra Leone [J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(7): 2368-2370. doi: 10.1128/JCM.00527-15.

[8] Southern TR, Racsa LD, Albario CG, et al. Comparison of FilmArray and Quantitative Real-Time Reverse Transcriptase PCR for Detection of Zaire Ebolavirus from Contrived and Clinical Specimens [J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(9): 2956-2960. doi: 10.1128/JCM.01317-15.

[9] 馬硝惟，李敏. 埃博拉病毒的實驗室檢測[J]. 中華臨床實驗室管理電子雜志，2014, 2(3): 148-151.

[10] Park DJ, Dudas G, Wohl S, et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone [J].Cell, 2015, 161(7): 1516-1526. doi: 10.1016/j.cell.2015.06.007.

[11] Gire SK, Goba A, Andersen KG, et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak [J]. Science, 2014, 345(6202): 1369-1372. doi: 10.1126/science.1259657.

[12] Broadhurst MJ, Kelly JD, Miller A, et al. ReEBOV Antigen Rapid Test kit for point-of-care and laboratory-based testing for Ebola virus disease: a field validation study [J]. Lancet, 2015, 386(9996): 867-874. doi: 10.1016/S0140-6736(15)61042-X.

[13] 劉瑋，房彤宇，曹務(wù)春. 埃博拉病毒病主要研究進(jìn)展及援非實驗室檢測 [J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2015, 36(9): 1023-1025. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.09.026.

[14] Su S, Wong G, Qiu X, et al. Diagnostic strategies for Ebola virus detection [J].Lancet Infect Dis, 2016, 16(3): 294-295. doi: 10.1016/S1473-3099(16)00049-9.

[15] http://www.fda.gov/emergencypreparedness/counterterrorism/medicalcountermeasures/mcmlegalregulatoryandpolicyframework/ucm182568.htm

Emergency use authorization for Ebola virus detection by FDA-approved techniques

GuYajun,SheTiantian,FuHongwei,QinWei,WangYichao,LiuYunde

SchoolofMedicalLaboratory,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300203,China(GuYJ,SheTT,FuHW,WangYC,LiuYD);LaboratoryCenter,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China(FuHW)，DepartmentofGeneralSurgery,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China(QinW)

LiuYunde,Email:yundeliu@126.com

Ebola virus (EBOV) is an aggressive pathogen that causes a highly hemorrhagic fever syndrome in humans and other mammalian species. Early detection and proper treatment is the best defense against EBOV because of high mortality rate (70%-90%). Currently, there are eleven FDA approved Ebola tests, kits, or assays for emergency use, which can be divided into two main categories: rRT-PCR and viral antigen methods. In BSL 4 lab, rRT-PCR is the most sensitive technique to detect nucleic acid of Ebola virus, including Ebola Zaire (EZ1) rRT-PCR (TaqMan) Assay, Ebola Virus NP and VP40 Real-time RT-PCR Assay,FilmArray NGDS BT-E and Biothreat-E test, RealStar Ebolavirus RT-PCR kit, LightMix Ebola Zaire rRT-PCR test, and Xpert Ebola Assay. Antigen-based technology (ReEBOV Antigen Rapid Test, and OraQuick Ebola Rapid Antigen Test) provides rapid Ebola antigen test without relying on special PCR equipment. How to develop, manufacture, and market point-of-care and field testing will be the next major challenge for EBOV on various samples.

FDA; emergency use authorization; Ebola; nucleic acid; antigen

劉運德，Email：yundeliu@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.020

美國食品藥品管理局；緊急使用授權(quán)；埃博拉；核酸；抗原

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計劃項目(20140124);天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(15JCQNJC11600;15JCYBJC27400)

2016-04-28)