周珺 龔甜 熊英 施勇

330029 南昌，江西省疾病預(yù)防控制中心

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·技術(shù)方法·

PCR-RFLP方法快速鑒別水痘-帶狀皰疹病毒野病毒與疫苗株

周珺 龔甜 熊英 施勇

330029 南昌，江西省疾病預(yù)防控制中心

目的 PCR-RFLP的方法快速鑒別2010-2015在江西省采集的水痘-帶狀皰疹標(biāo)本中的野病毒與疫苗株。方法 選取2010-2015年在江西省南昌市采集的的水痘-帶狀皰疹感染臨床診斷病例的皰疹液和咽拭子標(biāo)本共112份，分別使用特定引物對(duì)水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)ORF62區(qū)、ORF38區(qū)和ORF54區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物分別使用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、PstⅠ及BglⅠ進(jìn)行酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。結(jié)果 112份標(biāo)本中，39份標(biāo)本的病毒核酸經(jīng)特定區(qū)域的PCR擴(kuò)增后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切結(jié)果為SmaⅠ-、PstⅠ+及BglⅠ+，而疫苗株酶切的結(jié)果為SmaⅠ+、PstⅠ-及BglⅠ+。結(jié)論 PCR-RFLP方法可以快速鑒定VZV的野毒株與疫苗株，江西省2010-2015年采集的水痘-帶狀皰疹標(biāo)本中的VZV均為野病毒。

Fund programs: Science and Technology Plan of Jiangxi Province Health Department(20112001);National Science and Technology Major Projects of the 11thfive-year plan for Major Communicable Diseases, AIDS and Viral Hepatitis Prevention(2009ZX10004-207)

水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)又被稱為人類皰疹病毒3型(HHV-3)，是臨床上常見(jiàn)的水痘和帶狀皰疹疾病的病原體。Takahashi等在1974年利用水痘病毒野毒株Oka(Oka parent, pOka)成功研制出水痘減毒活疫苗株(Oka vaccine, vOka)并廣泛用于預(yù)防接種[1]，顯著降低了兒童罹患水痘和老年帶狀皰疹后出現(xiàn)遺神經(jīng)痛的發(fā)生率。目前在市場(chǎng)上采用的水痘疫苗均是1983年被世界衛(wèi)生組織推薦的日本的vOka株的減毒活疫苗。但因?yàn)樗灰呙缡菧p毒活疫苗有可能會(huì)引起突破感染或是產(chǎn)生疫苗相關(guān)病例，因此在廣泛使用該疫苗的同時(shí)，有必要檢測(cè)水痘病例或帶狀皰疹病例中的VZV毒株是由疫苗株還是野毒株感染引起。這對(duì)水痘疫苗接種效果的評(píng)價(jià)、疫苗的安全性及質(zhì)量控制等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2010-2015年在南昌市高新區(qū)醫(yī)院及采集的臨床診斷為水痘-帶狀皰疹患者的皰疹液和咽拭子標(biāo)本共112份，標(biāo)本采集后置于-70 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑DNA提取:試劑盒QIAmpDNA Mini kit(德國(guó)Qiagen公司，51306)，DNA擴(kuò)增試劑盒GoTaq Green Master Mix(Promega公司，0000031171)，限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、BglⅠ及PstⅠ(TaKaRa公司，D1085A，D1020A，D1073A)，瓊脂糖凝膠(上海生工，AB0016H-250G)，GOLD VIEW染料(Solarbio，G8140)，水痘病毒減毒活疫苗(長(zhǎng)春祈健生物制品有限公司，201301008)。

1.2.2 儀器:CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)NuAire)，PCR擴(kuò)增儀PTC-200(美國(guó)Bio-Rad)，凝膠電泳儀(北京六一)，全自動(dòng)凝膠成像儀(Vilber Lourmat)。

1.3 方法 使用QIAmpDNA Mini kit DNA提取試劑盒對(duì)原始標(biāo)本提取病毒核酸，提取過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；使用特異性引物擴(kuò)增相對(duì)應(yīng)的基因片段，引物序列及對(duì)應(yīng)所用的限制性內(nèi)切酶[2]。使用Promega公司的GoTaq Green Master Mix試劑對(duì)病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增。

參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的限制性內(nèi)切酶分析方法[3]及參考限制性內(nèi)切酶試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切反應(yīng)。

2 結(jié)果

使用三對(duì)引物對(duì)原始標(biāo)本的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共有39份標(biāo)本的產(chǎn)物濃度足夠進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)。對(duì)這些產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)使用引物PKVL6U/PKVL1L擴(kuò)增的ORF62區(qū)域的產(chǎn)物片段經(jīng)Sma I酶切可均被切分為3個(gè)片段(153 bp、79 bp、36 bp)，而疫苗株則能被切為4個(gè)片段(112 bp、79 bp、41 bp、36 bp)，即疫苗株有3個(gè)酶切位點(diǎn)(其中153 bp片段被切為112 bp及41 bp兩個(gè)片段)(見(jiàn)圖1)，而野毒株只有2個(gè)酶切位點(diǎn)，即野毒株表現(xiàn)為Sma I-、疫苗株為Sma I+；同時(shí)，各個(gè)標(biāo)本的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物皆可被Bgl I及Pst I酶切為兩個(gè)片段 (137 bp、85 bp和250 bp、100 bp)，而疫苗株則未能被Pst I酶切(見(jiàn)圖2)。最后能夠進(jìn)行酶切的39份標(biāo)本中的病毒皆為Bgl I及Pst I酶切陽(yáng)性，均為VZV病毒野毒株。

圖1 部分標(biāo)本Sma I酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of the PCR products digested by Sma I

圖2 部分標(biāo)本Bgl I及Pst I酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of the PCR products digested by Bgl I and Pst I

3 討論

VZV原發(fā)感染表現(xiàn)為水痘，主要的發(fā)病人群為兒童，主要以皮膚和黏膜上出現(xiàn)皰疹并且伴有發(fā)熱為特征；而在水痘癥狀痊愈后，病毒并不能被機(jī)體完全清除，它常在一個(gè)或多個(gè)脊髓后根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)中潛伏下來(lái)形成潛伏感染。當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，病毒會(huì)再被激活并復(fù)制，沿神經(jīng)軸突到達(dá)相應(yīng)神經(jīng)所支配的胸、腹或面部的皮膚，并在局部細(xì)胞內(nèi)增殖，引發(fā)周圍神經(jīng)炎及相應(yīng)分布區(qū)域皮膚的炎癥，臨床表現(xiàn)為在相應(yīng)神經(jīng)支配的皮膚上出現(xiàn)皰疹，并產(chǎn)生神經(jīng)痛。因病灶主要呈帶狀分布，故又常被稱為帶狀皰疹[4，5]。

水痘疫苗接種仍后可發(fā)生水痘樣皮疹，接種的疫苗也可潛伏體內(nèi)引發(fā)出帶狀皰疹。美國(guó)一項(xiàng)調(diào)查顯示：水痘減毒活疫苗不能提供100%完全的保護(hù)，疫苗接種后數(shù)月到數(shù)年內(nèi)，約有5%兒童和10%成人仍有可能感染VZV，一部分是“突破(breakthrough)感染”，即疫苗沒(méi)有起到保護(hù)的效果而使機(jī)體仍然被病毒感染，而另外一部分則是由疫苗株引起的占40%[6，7]，是為疫苗相關(guān)病例。所以水痘疫苗接種者仍然發(fā)生水痘或帶狀皰疹可能是由野毒株或疫苗株感染所致[8]。因疫苗株可引起感染導(dǎo)致水痘，不僅如此，它還可與野生毒株一樣，潛伏在接種者的感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中，并能被再次激活而引發(fā)帶狀皰疹[4]，因此在廣泛使用減毒活疫苗的同時(shí)，也有必要檢測(cè)水痘或帶狀皰疹病例感染的VZV病毒是否由疫苗株引起。這對(duì)水痘疫苗接種效果的評(píng)價(jià)、疫苗的安全性及質(zhì)量控制等具有重要意義。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)的原理是檢測(cè)DNA被限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變(新產(chǎn)生的或去除酶切位點(diǎn))和一段DNA的重新組織(如插入或缺失造成酶切位點(diǎn)間長(zhǎng)度發(fā)生變化)等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的鑒定VZV毒株是否為野毒株基本都是使用PCR-RFLP的方法。一些早期研究發(fā)現(xiàn)，在北美和歐洲，絕大多數(shù)VZV毒株在ORF38中基因組核苷酸中都含Pst I酶切位點(diǎn)(即PstI+)，而在ORF54中不含Bgl I酶切位點(diǎn)(即Bgl I-)；而源自日本的疫苗株，因點(diǎn)突變失去了Pst I酶切位點(diǎn)(PstI-)，卻形成了一個(gè) BglI酶切位點(diǎn)(即BglI+)。因此在早先的研究中，曾提出以Pst I和Bgl I雙酶切來(lái)區(qū)分野毒株和疫苗株[9，10]。而Loparev等[2]建立了一種更為簡(jiǎn)單的方法可以鑒定和區(qū)別VZV野毒株和減毒疫苗株：通過(guò)病毒基因組測(cè)序比較發(fā)現(xiàn)，疫苗株vOka ORF62中因點(diǎn)突變?cè)黾恿艘粋€(gè)Sma I酶切位點(diǎn)(Sma I+)，而野毒株則沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)，故此位點(diǎn)為疫苗株所獨(dú)有?？梢允褂肧ma Ⅰ對(duì)ORF62區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,因疫苗株中有3個(gè)SmaⅠ酶切位點(diǎn)，能被切為4個(gè)片段，而野毒株中只有2個(gè)，只能被切為3個(gè)片段。該方法能準(zhǔn)確的將疫苗株和流行于6個(gè)洲的野毒株區(qū)別開(kāi)來(lái)。

本研究收集到的39份標(biāo)本中的VZV均為VZV野毒株，時(shí)間橫跨2010年至2015年，這說(shuō)明江西省一直都有VZV的野病毒流行，而我省這些野病毒的酶切結(jié)果均為Sma I-、Pst I+及Bgl I+，這與日本本土流行的野毒株pOKa株(Sma I-、Pst I-及Bgl I+)不一樣，與我國(guó)李崇山[11]、陳婷婷等[5]的報(bào)道一致，說(shuō)明我省乃至我國(guó)流行的VZV毒株大多數(shù)為Sma I-、Pst I+及Bgl I+，但甘霖[12]等研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)也存在PstI-的野毒株，說(shuō)明我國(guó)也可能有類似日本本土流行株的野毒株存在，甚至有可能存在與北美歐洲等地流行相同的野毒株，這有待更多的研究來(lái)發(fā)現(xiàn)。本研究驗(yàn)證了通過(guò)Sma I酶切的方法可以快速鑒別VZV疫苗株與野毒株，與Pst I及Bgl I聯(lián)用更可以鑒別是否有與日本本土的相同的流行野毒株，而不用通過(guò)測(cè)序的方法來(lái)進(jìn)行鑒別，可以節(jié)省較多的時(shí)間，使用的儀器設(shè)備及試劑耗材也較為簡(jiǎn)單，利于一些基層實(shí)驗(yàn)室或只有基本條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究，也利于在我國(guó)更廣泛的開(kāi)展水痘-帶狀皰疹的監(jiān)測(cè)工作。

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Rapid identification varicella zoster virus wild and vaccine strains by PCR-RFLP

ZhouJun,GongTian,XiongYing,ShiYong

JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China

ZhouJun,Email：94396465@qq.com

Objective To rapidly identify wild strains and vaccine strains of varicella zoster virus(VZV) by PCR-RFLP in Jiangxi province in 2010-2015. Methods We have collected 112 herpes fluid and throat swab specimens from clinical diagnosis cases of varicella zoster in Nanchang from 2010 to 2015, extracted virus DNA from the specimens, used the specific primers of ORF62, ORF38 and ORF54 areas,and used restriction enzymes SmaⅠ, PstⅠ and BglⅠto do fragment length polymorphism analysis.Results We have analysised results the of 39 positive PCR products and all the products can be digested by SmaⅠ-, PstⅠ+and BglⅠ+,but the RFLP result of vaccine is SmaⅠ+, PstⅠ-and BglⅠ+.Conclusions The wild strains and vaccine strain of VZV be identified by the method of PCR-RFLP and the VZV the specimens collected in Jiangxi Province from 2010 to 2015 are all wild strains.

Varicella zoster virus (VZV); Wild strains; Vaccine strains; PCR-RFLP

周珺 Email：94396465@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.018

水痘-帶狀皰疹病毒；野毒株；疫苗株；PCR-RFLP

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃課題(20112001)；國(guó)家“十一五”科技重大專項(xiàng)“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”(2009ZX10004-207)

2016-05-17)