馬廣源 劉瑞霞 肖勇 鮑靜 季亞勇 吳家林 凌霞

214023 無錫市疾病預防控制中心(馬廣源、肖勇、鮑靜、季亞勇、吳家林、凌霞)；250031 濟南市技師學院(劉瑞霞)

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·論著·

2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒流行特征與分型

馬廣源 劉瑞霞 肖勇 鮑靜 季亞勇 吳家林 凌霞

214023 無錫市疾病預防控制中心(馬廣源、肖勇、鮑靜、季亞勇、吳家林、凌霞)；250031 濟南市技師學院(劉瑞霞)

馬廣源、劉瑞霞為共同第一作者

目的 了解2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒的流行的基因型及規(guī)律。 方法 對2011-2013年無錫市人民醫(yī)院送檢的1 893份急性呼吸道感染標本，用Real-time PCR方法擴增腺病毒基因，檢出的陽性標本接種Hep-2細胞分離病毒，然后對其擴增產(chǎn)物進行純化和測序比對，所得基因序列用Bioedit和MEGA 5.0進行進化樹分析。結(jié)果 2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒全年都有出現(xiàn)，多發(fā)生在冬春季，1-3歲的兒童檢出率(44.26%)最高，型別主要有B亞群的HAdV-3型4株(13.33%)、HAdV-7型6株(20.00%)和C亞群HAdV-1型5株(16.66%)、HAdV-2型8株(26.67%)、HAdV-5型3株(10.00%)、HAdV-6型4株(13.33%)?；蜻M化樹形成2個獨立的分支，C亞群逐漸成為優(yōu)勢株。結(jié)論 2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在冬春季，1-3歲的兒童是主要的易感人群。B和C兩種亞群6個血清型為優(yōu)勢流行株，推測有B亞群向C亞群轉(zhuǎn)變的流行趨勢。

FondPrograms:ScienceandTechnologyProjectofWuxiScience&TechnologyBureau(CSE31N1430)

急性呼吸道感染(Acuterespiratorytractinfec-tion，ARTI)是全球范圍內(nèi)人類最常見的傳染性疾病之一[1]，發(fā)病率居急性傳染病的首位。ARTI也是威脅兒童健康的主要因素，造成每年大約200萬兒童死亡，已成為5歲以下兒童死亡的第二大病因[2]。人腺病毒(Hadv)是引起全球5-10%幼兒和兒童急性呼吸道感染的主要原因，即使在發(fā)達國家，低于5歲的兒童急性呼吸道感染較高的死亡率和發(fā)病率也造成了一定的社會負擔[3]。到目前為止，人腺病毒已發(fā)現(xiàn)有60多種血清型[4,5]，A-G7種亞屬,型別C1、C2、C5、C6、B3、B7、B11和E4是導致人主要急性呼吸道感染的主要原因。為了解和掌握在無錫地區(qū)流行的腺病毒的基因型和特征，對2011-2013年流行的腺病毒進行病毒分離、病毒基因測序以及種屬分布及基因特征分析，為預防和控制腺病毒引起的相關(guān)傳染病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 從無錫市人民醫(yī)院(兒童醫(yī)院)采集發(fā)病3d以內(nèi)的急性呼吸道感染病例(發(fā)熱、白細胞分布異常，咽部不適、鼻塞、流涕、咳嗽等臨床表現(xiàn)者，缺乏其他實驗室確定診斷依據(jù))的鼻咽拭子或含漱液標本，在4 ℃保存條件下于24h內(nèi)送至實驗室。

1.2 病毒核酸提取及Real-timePCR檢測 用羅氏公司的RocheMagNAPureLC2.0 全自動核酸提取儀提取總核酸(DNA/RNA)，提取物用100μl洗脫液溶解，立即置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?yīng)用北京金豪科技有限公司的熒光定量RT-PCR核酸檢測試劑盒檢測腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。

圖1 2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒流行Fig.1 Prevalence of human adenoviruses in Wuxi area from 2011 to 2013

1.3 Hep-2細胞培養(yǎng) 選擇熒光PCR檢測結(jié)果為腺病毒陽性的標本，0.22 μm濾膜過濾，接種長成單層的Hep-2細胞，常規(guī)培養(yǎng)，每日觀察細胞病變。

1.4 Hexon基因擴增及序列測定 合成腺病毒Hexon基因測序引物，用TaKaRa公司的EX Taq 試劑盒(Drr001r)進行擴增，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定序列。

1.5 基因比對和種系發(fā)生樹構(gòu)建 使用Bioedit 進行序列的比對和分析, MEGA version 4.0 軟件繪制基因種系發(fā)生樹，進化樹構(gòu)建采用鄰位相臨法(Neighbor-Jointing, N-J)。

2 結(jié)果

2.1 2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒流行情況 2011-2013年共檢測到人腺病毒61株，這期間甲型流感病毒和乙型流感病毒共同流行。人腺病毒占同期所有標本的3.22%(61/1 893)，而甲型流感病毒占同期所有標本的6.55%(124/1 893)，乙型流感病毒占同期所有標本的3.75%(71/1 893)。從圖1看出人腺病毒在全年都有出現(xiàn)，多發(fā)生在冬春季，夏季僅在2011年的6月份出現(xiàn)4株，2013年的6、7月各出現(xiàn)1株，其余均未檢測到。

2.2 人腺病毒感染人群分布和臨床特征 61份檢出陽性標本的感染人群都為兒童，最小2個月，最大8歲。感染患兒各年齡段都有分布，小于1歲的患兒有11例，占18.03%；1-3歲的兒童發(fā)病率最高有27例，占44.26%；3-6歲的兒童有15例，占24.59%；大于6歲的兒童有8例，占13.11%。男、女性別比例為29∶32。61份感染人群中有發(fā)熱癥狀的45例，占73.77%；有咳嗽癥狀的36例，占59.02%；有咽炎癥狀的30例，占49.18%；有肌肉酸痛癥狀的30例，占49.18%；有肺炎癥狀的26例，占42.62%。

圖2 2011-2013年無錫地區(qū)人腺病毒hexon基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HAdV hexon gene in Wuxi area during 2011-2013

2.3 2011-2013年無錫市人腺病毒分子分型特征 61份核酸陽性標本進行病毒分離，有30份出現(xiàn)明顯的細胞病變，病毒分離率為49.18%。對這30份標本進行病毒基因PCR擴增、測序并鑒定其型別。30株分離株序列及GenBank中19株人腺病毒代表株序列進行種系進化樹分析，結(jié)果顯示2011-2013年30株人腺病毒分離株分屬2個進化分支，屬于2個亞群(亞群B、C)中的6種型別。C亞群占66.67(20/30)，B亞群占33.33%(10/30)。三年中都出現(xiàn)B亞群和C亞群，2011年B亞群居多有5株、而C亞群只有2株；2012年B亞群有3株、C亞群有8株；2013年B亞群有2株、C亞群有10株。B亞群中HAdV-3型2012年未檢出，而C亞群中HAdV-6型2011年沒有出現(xiàn)，HAdv-5型僅在2013年出現(xiàn)。由此可看出無錫地區(qū)腺病毒流行趨勢由B亞群向C亞群轉(zhuǎn)變。

2.4 各型別腺病毒hexon基因核苷酸序列親緣性關(guān)系及氨基酸同源性分析 利用 Bioedit 和 MEGA5.0 軟件對HAdV-3、7、1、2、5、6序列及 Genbank中相應(yīng)型別hexon基因全長序列參考株進行親緣性關(guān)系分析，其中Hadv-3參考株1株、HAdV-7參考株1株、HAdV-1參考株1株、HAdV-2參考株3株、HAdV-5參考株1株、HAdV-6參考株1株。從圖2清晰的看到，2011-2013年無錫市20株人腺病毒Hexon基因分處進化樹的B、C亞群，分支獨立，彼此間親緣關(guān)系清晰。各HAdV型別與其對應(yīng)的參考株同源性較高，同源性在96.13%-100%之間，最高同源性為HAdV-7型，最低同源性為HAdV-6型。

3 討論

腺病毒是引起人急性呼吸道感染的重要病毒病原之一，在不同國家、地區(qū)流行的腺病毒都會有所不同[6]，有些型別可能在一個國家多個地區(qū)之間交替流行[7]。北方地區(qū)如北京2003-2012年監(jiān)測結(jié)果顯示呈全年散發(fā)，沒有明顯的季節(jié)差異，1-3歲為易感人群[8]。南方地區(qū)如蘇州2005-2007年腺病毒住院感染病例呈春、夏季明顯高于秋、冬季，1-2歲檢出最多[9]。無錫地區(qū)2011-2013年監(jiān)測結(jié)果顯示Hadv呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性，主要以冬春季為主，夏季檢出很少；1-3歲的兒童發(fā)病率最高，占44.26%；大部分患兒伴有發(fā)熱、咳嗽等癥狀。

本研究報道了2011-2013 年間無錫地區(qū)兒童感染呼吸道腺病毒的流行狀況及分型結(jié)果，顯示近三年引起呼吸道腺病毒感染的型別主要為B、C亞群，而B亞群主要為3型和7型，這與中國其它地區(qū)關(guān)于HAdV的檢測結(jié)果相似，也與亞洲地區(qū)[10]主要以HAdV-3、7在兒童呼吸道感染中占主要地位結(jié)果一致。但是在本次研究中C亞群成為主導毒株，與其他研究結(jié)果[11,12]B亞群為主導不同。從進化結(jié)果來看有B亞群向C亞群轉(zhuǎn)變的流行趨勢，且在2013年C亞群檢出Hadv-5型。從親緣進化樹和氨基酸同源性分析的結(jié)果來看，本研究中腺病毒各型別序列與相應(yīng)參考株的氨基酸的同源性均較高，且均未發(fā)現(xiàn)明顯的變異，Hadv-7型同源性非常之高。腺病毒是DNA病毒，它們的進化速度相對較慢。

腺病毒引起的兒童感染近幾年趨勢有明顯的回升，且癥狀比較重，個別地方會出現(xiàn)散在性暴發(fā)疫情。因此，我們應(yīng)該加強對腺病毒分子流行病學的連續(xù)監(jiān)測，開展流行病學調(diào)查、疫苗研發(fā)就顯得尤為重要。

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Epidemiological characteristic and typing of human adenovirus in Wuxi area of 2011-2013

MaGuangyuan，LiuRuixia,XiaoYong，BaoJing，JiYayong，WuJialin，LingXia

WuxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuxi214023,China(MaGY,XiaoY,BaoJ,JiYY,WuJL,LingX);Ji′nanTechnicanColloge,Ji′nan250031,China(LiRX)

MaGuangyuanandLiuRuixiaarethdfirstauthorswhocontributedequallytothearticle

LingXia，Email：mgy2004165@163.com

ObjectiveTostudytheepidemiologicalcharacteristicsandtypeofhumanadenovirus(HAdv)inWuxiareain2011-2013.MethodsAtotalof1983acuterespiratoryinfectionssampleswerecollectedfromWuxiPeople′sHospitalduring2011-2013.HAdvwasdetectedbyReal-timePCR,thepositivesampleswereinoculatedintoHep-2cellstoisolatetheviruses.Theamplificonswerepurifiedandsequenced,andthesequenceswereanalyzedbyBioeditandMEGA5.0.ResultsHumanadenoviruswasappearedthroughouttheyearinWuxiareaduring2011-2013.Inwinterandspring,thehighestrate(44.26%)wasdetectedin1-3yearsoldchildren.Therewere4strains(13.33%)forHAdV-3, 6strainsforHAdV-7(20.00%)ofBsubgroup,5strains(16.66%)forHAdV-1, 8strains(26.67%)forHAdV-2, 3strains(10.00%)forHAdV-5, 4strains(13.33%)forHAdV-6ofCsubgroup.ThephylogenetictreeformedtwoindependentbranchesandCsubgroupgraduallybecameadvantage.ConclusionsHumanadenovirushadobviousseasonalcharacteristicsinWuxiareaduring2011- 2013,mainlyinwinterandspring; 1-3yearsoldchildrenwerethemainsusceptiblepopulation.SixtypesofBandCsubgroupswerethedominantepidemicstrains,withtheepidemictendencytransformedfromsubgroupBtoC.

HumanAdenovirus；EpidemiologicalCharacteristics；Genotype

凌霞，Email：mgy2004165@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.010

人腺病毒；流行特征；基因型

無錫市科技局支持項目(CSE31N1430)

2016-06-06)