趙嘉詠 申曉靖 張白帆 黃麗莉 夏勝利 黃學(xué)勇 許汴利

450016 鄭州,河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病所實驗室

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·論著·

河南省2012-2015年兒童A組輪狀病毒病原學(xué)監(jiān)測及基因型別分析

趙嘉詠 申曉靖 張白帆 黃麗莉 夏勝利 黃學(xué)勇 許汴利

450016 鄭州,河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病所實驗室

目的 分析2012-2015年河南省5歲以下腹瀉兒童A組輪狀病毒的感染狀況及病原學(xué)特征，為A組輪狀病毒感染的監(jiān)測、防控及爆發(fā)病例的調(diào)查及疫苗研發(fā)提供基線數(shù)據(jù)和方法學(xué)參考。方法 采集河南省兩個監(jiān)測哨點醫(yī)院5歲以下兒童腹瀉病例的糞便樣本1 433份。雙抗體夾心法檢測A組輪狀病毒，陽性樣本抽提病毒RNA，兩步巢式多重RT-PCR進行G/P基因分型。結(jié)果 1 433份腹瀉樣本共檢出A組輪狀病毒482份，總陽性率33.6%；輪狀病毒檢出率的季節(jié)性特征顯著，存在秋季(9-11月份)和春季(3-5月份)兩個較為顯著的高峰。A組輪狀病毒G分型以G1、G2、G3、G9為主；P分型以P[4]、P[8]為主；型別組合以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]為主；還存在混合感染型別。陽性病例中，男女性別比1.4∶1；以4-12個月齡的嬰幼兒為主；農(nóng)村感染率高于城市；臨床癥狀以輕中度腹瀉為主，部分病例存在發(fā)熱、嘔吐、脫水等現(xiàn)象。結(jié)論 河南省5歲以下腹瀉患兒中存在較高的A組輪狀病毒感染率，以秋季和春季為主，且存在混合感染病例；病原體可分為多種基因型別，G9P[8]為優(yōu)勢型別；大部分感染病例以輕癥為主。

Fundprograms:NationalScienceandTechnologyMajorProjectsofChina(2012ZX10004201; 2012ZX10004215);ScientificandTechnologicalProjectofHenanProvinve“Moleculartypingandnetworktracingtechnologyapplicationresearchofbacterialpathogens(152102310133)”

人感染A組輪狀病毒(HumanRotavirusA，HRVA)是一種雙鏈RNA病毒，呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒秋季腹瀉的主要病原體之一，其通過感染小腸黏膜上皮細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷，引起滲透性腹瀉病。A組輪狀病毒在每年的秋冬季流行，感染途徑為糞—口途徑，臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎，可導(dǎo)致發(fā)熱、嘔吐、腹瀉及脫水等嚴(yán)重并發(fā)癥[1，2]。本研究對河南省2012-2015年采集自5歲以下嬰幼兒腹瀉糞便中的A組輪狀病毒進行病原學(xué)檢測與基因型別分析，為其疾病監(jiān)測、防控策略制定、暴發(fā)疫情調(diào)查及疫苗研發(fā)提供基線數(shù)據(jù)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 依據(jù)中國疾控中心《全國病毒性腹瀉監(jiān)測方案(2007版)》制定的病毒性腹瀉病例定義，對河南省鄭州市和開封市兩家兒童醫(yī)院5歲以下(1-59月齡)腹瀉患兒，每日排便3次或3次以上，且大便性狀有改變，呈稀便、水樣便等；大便常規(guī)鏡檢WBC<15，未見RBC的病例進行腹瀉樣本采集。2012年332份，2013年375份，2014年311份，2015年415份，共計1 433份。

1.2 樣本采集與保存 糞便標(biāo)本在患者發(fā)病3d內(nèi)或入院24h內(nèi)采集，固體便每份取5-10g，水樣便或稀便每份取5-10ml，采集的標(biāo)本放入螺口采樣盒中置于-20 ℃凍存，在檢測前避免反復(fù)凍融。

1.3 試劑與儀器 雙抗體夾心法ELISA檢測試劑盒購自英國Oxoid公司；磁珠法病毒核酸提取試劑盒購自西安天隆科技公司；SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國invitrogen公司；dNTPMIX、GoTaqDNA聚合酶購自美國Promega公司；引物(HPLC純化)由上海invitrogen合成；100bpMarker購自大連寶生物生物技術(shù)公司；電泳瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；50×TAE電泳緩沖液購自北京Solarbio公司。自動核酸提取儀購西安天隆科技公司；去離子水系統(tǒng)購自美國Milipore公司；Minispin臺式離心機、PCR儀購自德國Eppendorf公司；核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 樣本抗原檢測 糞便樣本置于室溫自然解凍，每人份取0.1g固體糞便或100μl液體糞便標(biāo)本加入1.0ml樣品稀釋液(試劑盒所配)至1.5mlEP管中，參照試劑盒說明書進行樣本處理與檢測。

1.5 病毒RNA的提取及A組輪狀病毒基因分型 取樣本稀釋液200μl，使用磁珠法自動核酸提取儀(西安天隆NP968型)進行病毒總RNA提取。提取產(chǎn)物參照世界衛(wèi)生組織(WHO)輪狀病毒參比實驗室提供的A組輪狀病毒G(病毒外殼蛋白VP4)/P(病毒外殼蛋白VP7)基因分型引物序列及試驗方案進行，其中G分型包括G1/G2/G3/G4/G8/G9/G10/G11 8條引物，P分型包括P4/P6/P8/P9/P10/P11 6條引物。

1.6 電泳與結(jié)果判斷 取10μlPCR擴增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(140V,30min)。根據(jù)特異性核酸條帶大小和數(shù)目組合判斷A組輪狀病毒基因類別。

2 結(jié)果

2.1A組輪狀病毒ELISA檢測 1 433份腹瀉樣本共檢出A組輪狀病毒482份，總陽性率33.6%。其中2012年檢出107份，陽性率32.2%(107/332)；2013年檢出174份，陽性率46.4%(174/375)；2014年檢出86份，陽性率27.7%(86/311)；2015年檢出115份，陽性率27.7%(115/415)。分月份看，每年的10月份陽性率最高，4年的平均陽性率為57.5 %；陽性率最低的是每年的7月份，4年的平均陽性率為3.0%。檢出率的季節(jié)性變化顯著，存在秋季(9-11月份)和春季(3-5月份)兩個較為顯著的高峰(圖1)。

圖1 2012年-2015年河南省腹瀉樣本A組輪狀病毒檢出率變化趨勢Fig.1 Detection rate trend of rotavirus A in Henan province from 2012 to 2015

2.2 A組輪狀病毒GP基因分型結(jié)果 482株A組輪狀病毒G分型為G1、G2、G3、G4、G9；以G1、G2、G3、G9為主；P分型為P[4]、P[6]、P[8]、P[9]；以P[4]、P[8]為主。A組輪狀病毒型別有G1P[8]，G2P[4]，G2P[8]，G3P[8]，G4P[9]，G9P[4]，G9P[8]，以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]為主。另外經(jīng)測序證實還存在混合感染的型別，有G1G3P[8]，G2G3G4P[8]，G3G9P[8]，G3G8G9P[6][8](表1，圖2)。

表1 2012年-2015年河南省A組輪狀病毒G/P基因分型

注：P[+]為P未分型

Note:P[+] untyped P

M:100 bp DNA marker; G9P[8]:1,2,5,6,8,9,11,13,16:G2P[4]:3,7,12,14;Mix types:4,10,15 圖2 A組輪狀病毒G/P分型 Fig.2 Map of rotavirus A G/P genotyping

2.3 A組輪狀病毒感染病例流行病學(xué)資料分析 482例A組輪狀病毒感染病例中，279例為男性，203例為女性，男女性別比1.4∶1；年齡分布為：0-3個月32例(6.6%)，4-6個月211例(43.8%)，7-12個月104例(21.6%)，1歲-2歲54例(11.2%)，2歲-3歲40例(8.3%)，3歲-4歲29例(6.0%)，4歲-5歲12例(2.5%)，陽性病例主要為4-12個月齡的嬰幼兒患者；城市陽性病例224例，陽性率25.8%(224/867);農(nóng)村陽性病例258例，陽性率45.6%(258/566)；從臨床體征看，431例陽性病例體溫在37 ℃以下(89.4%)，29例體溫在37-37.5 ℃間(6.0%)，14例體溫在37.6-38 ℃間(2.9%)，8例體溫在38 ℃以上(1.6%)，大部分的陽性病例不發(fā)熱或輕度發(fā)熱；89例腹瀉次數(shù)在0-3次(18.5%)，275例腹瀉次數(shù)在4-6次(57.1%)，78例腹瀉次數(shù)在7-9次(16.2%)，40例腹瀉次數(shù)在10-15次(8.3%)，陽性病例以輕度和中度腹瀉為主；437例未發(fā)生嘔吐(90.7%)，17例發(fā)生1次嘔吐(3.5%)，21例發(fā)生2次嘔吐(4.4%)，5例發(fā)生3次嘔吐(1.0%)，2例嘔吐在4次以上(0.4%)，陽性病例絕大部分未出現(xiàn)嘔吐癥狀；398例未發(fā)生脫水現(xiàn)象(82.6%)，81例發(fā)生1%-5%的輕度脫水現(xiàn)象(16.8%)，3例發(fā)生5%以上的中重度脫水現(xiàn)象(0.6%)。

3 討論

病毒性腹瀉，又稱為病毒性胃腸炎，在我國傳染病防治法中被列為丙類傳染病。輪狀病毒由澳大利亞的Ruth Bishop于1973年進行電鏡研究時首次發(fā)現(xiàn)，根據(jù)病毒內(nèi)殼蛋白VP6抗原性不同將RV分為A-G 7個組，其中A、B、C三組可以感染人[3]。A組輪狀病毒為較為少見的雙鏈RNA病毒，顆粒直徑70 nm，二十面體對稱，是5歲以下兒童感染性重癥胃腸炎(腹瀉)的主要病原，其通過侵犯小腸絨毛柱狀上皮細(xì)胞，引發(fā)腸道吸收功能障礙及水樣腹瀉，導(dǎo)致脫水、電解質(zhì)失衡與酸中毒，還可通過胃腸道屏障到達血液循環(huán)與淋巴循環(huán)系統(tǒng)，從而引發(fā)病毒血癥和多臟器損害，是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉和死亡的重要疾病之一，占腹瀉住院兒童的比例為20%-60%。根據(jù)WHO估算，全球范圍內(nèi)每年大約引起61.1萬嬰兒和兒童死亡，特別是在非洲，亞洲及南美洲等發(fā)展中國家[4，5]。輪狀病毒感染屬于自限性疾病，由于常規(guī)的衛(wèi)生和消毒措施對阻止病毒感染的效果并不明顯，接種疫苗成為了當(dāng)前世界范圍內(nèi)預(yù)防該病的主要醫(yī)療手段。2009年6月，WHO已建議把輪狀病毒疫苗接種列入所有國家的免疫規(guī)劃中[6]。由于A組輪狀病毒抗原型別的復(fù)雜性、多樣性及變異性，持續(xù)開展其病原學(xué)監(jiān)測，掌握其感染狀況及基因型別的分布和變異趨勢對于開展疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查，制定防控策略能夠提供重要的基線數(shù)據(jù)，同時為疫苗研發(fā)和改進也提供了最關(guān)鍵的參考依據(jù)。

A組輪狀病毒核衣殼蛋白可分為外殼蛋白和內(nèi)殼蛋白，外殼蛋白以VP4和VP7為主，是A組輪狀病毒主要的抗原決定子，其所對應(yīng)核酸序列是進行G/P基因分型的依據(jù)。全球不同地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查表明，不同的時間、不同的地區(qū)其流行株有較大差異。 Gl/G2/G3/G4、P[4] /P[6]/P[8]是世界范圍內(nèi)包括中國最常見的優(yōu)勢株型，直到上世紀(jì)90年代中葉，最常見的四種組合依然為G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]和G4P[6][7，8]。近年來，HRVA又呈現(xiàn)新的分子流行病學(xué)特點，G9型呈快速上升趨勢，G9P[8]型別已成為第5種新的流行型別[9]。從本研究看，河南省HRVA的基因型別以G9P[8]、G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]為主，這和目前世界范圍的HRVA的病原學(xué)特征和流行趨勢是一致的。從河南省的歷史監(jiān)測數(shù)據(jù)看，G9P[8]是型別占比上升最為迅速的型別，其從2006年的不足3%升至2015年的65.6%，已成為河南省5歲以下兒童HRVA感染的主要型別。另外河南省HRVA病原學(xué)的另一個特點就是存在混合感染型別，由于HRVA的易感性、抗原多樣性及機體感染后免疫力難以持久和交叉免疫保護力弱等特點，5歲以下兒童感染率可接近100%，且易形成不同型別的反復(fù)感染，因此在同一病人體內(nèi)檢測出多種型別的混合感染是可以解釋的。

從陽性病例的流行病學(xué)資料來看，河南省HRVA感染的男性多于女性，年齡分布以4個月-1歲為主，2歲-5歲間感染率呈下降趨勢。農(nóng)村感染率顯著比城市高，這與河南省細(xì)菌性腹感染率瀉的城鄉(xiāng)差別一致。臨床癥狀主要還是以輕癥腹瀉為主，體現(xiàn)了HRVA致病力和毒力較弱的特點。從檢出率的時間變化趨勢看，河南省的HRVA感染除了具有“秋季腹瀉”的季節(jié)性特點外，在春季也存在一個小高峰。研究表明，HRVA的環(huán)境存活狀況與溫度和濕度密切相關(guān)[10]，河南省作為中部偏北地區(qū)，春季和秋冬季大氣環(huán)境方面近似，溫度與濕度相差不大，客觀上為HRVA的繁殖和傳播提供了一個相對適宜的環(huán)境，也是春季檢出率偏高的主要原因之一。

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Rotavirus A pathogen surveillance and gene typing analysis in Henan Province from 2012 to 2015

ZhaoJiayong,ShenXiaojing,ZhangBaifan,HuangLili,XiaShengli,HuangXueyong,XuBianli

InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China

XuBianli,Email:xubl@hncdc.com.cn

ObjectiveToanalyzingtheinfectiousstatusandetiologicalcharacteristicsofrotavirusAfromchildrenlessthanfiveyearsoldinHenanprovincefrom2012to2015,toprovidebaselinedataandmethodological

forthediseasesurveillence,andcontroloutbreakcasesinvestigationsaswellasvaccineresearchanddevelopment.Methods1 433stoolsampleswerecollectedfromchildrenlessthanfiveyearsoldintwosentinelhospitalsandtransportedtolaboratoryinminustwentydegreesanddetectedgroupArotaviruspathogensbydoubleantibodysandwichELISAmethod.ViralRNAwasextractedfrompositivesamplesandmadeG/Pgenetypingwascontinuedwithtwo-stepnestedmultiplexRT-PCR.Results482positivesamplesofgroupArotavirusweredetectedfrom1 433diarrheasamplesandthetotalpositiveratewas33.6%,thereweretwoseasonaldetectionpositiveratepeakswithautumn(9-11months)andspring(3-5months).GtypingofgroupArotavirusweremainlyG1,G2,G3,G9;PtypingweremainlyP[4], [8];genetypecombinationwerecomposedmainlyofG9P[8],G2P[4],G3P[8],G1P[8]withexistingmixedinfectiontype.IngroupArotavirusinfectionssamples,sexratiowas1.4:1 (male279/female203);positivecasesweremainlyfocusedon4-12monthsoldinfantpatients(65.4%, 315/482)andtheinfectionrateinruralareaswashigherthanthatinurbanareas;clinicalsymptomsweremainlymild-to-moderatediarrheaandsomecaseshadfever,vomiting,dehydrationandotherphenomena.ConclusionsThereexistedratherhighinfectionrateofgroupArotavirusinacutediarrheachildrenlessthan5yearsoldinHenanprovinceincludingpartmixedinfectioncases,mainlyinautumnandspringannually,whichcanbedividedintoavarietyofgenotypes,G9P[8]wasthedominanttype;mostinfectedcasesshowedmilddegrees.

Rotavirus;Genotyping;Clinicalfeatures

許汴利，Email: xubl@hncdc.com.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.004

輪狀病毒屬；基因型；臨床特征

十二五科技重大專項“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治專項”(2013ZX10004203； 2012ZX10004215)；河南省科技攻關(guān)課題“細(xì)菌性病原體分子分型與網(wǎng)絡(luò)化溯源技術(shù)應(yīng)用研究(152102310133)”

2016-03-10)