柳潔，張園，崔毓桂，高莉，公益明，劉嘉茵

·論著·

早期絨毛和足月分娩胎盤組織中雌二醇水平測定及其意義

柳潔，張園，崔毓桂，高莉，公益明，劉嘉茵

目的：通過檢測自然妊娠早期孕婦外周血及絨毛組織、足月分娩時孕婦外周血、胎盤組織以及臍動脈血中雌二醇（E2）水平，并體外培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞系BeWo細胞，探討E2的作用。方法：本研究納入20例非意愿妊娠行妊娠早期流產(chǎn)者、20例足月妊娠行剖宮產(chǎn)者，采用化學發(fā)光免疫分析（CLIA）檢測妊娠早期流產(chǎn)絨毛組織、孕婦外周血以及足月分娩時孕婦外周血、臍動脈血和胎盤組織中E2水平。單層培養(yǎng)BeWo細胞，用0 mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L、5×10-9mol/L濃度的E2各處理1，3，6，12 h后，用Millicell ESR-2測定其跨膜電阻（TEER），觀察BeWo細胞間緊密連接的完整性。結(jié)果：妊娠早期的孕婦血清E2濃度［（3.44±1.30）nmol/L］低于足月妊娠孕婦［（509.78±197.82）nmol/L］，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.2，P＜0.001）；而絨毛組織中E2濃度［（30.82±13.91）pmol/mg］顯著高于足月胎盤組織中E2濃度［（17.21± 5.37）pmol/mg］，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.1，P＜0.001）。用5×10-7mol/L的E2處理BeWo細胞12 h后，TEER下降（P＜0.05）；5×10-8mol/L和5×10-9mol/L E2處理對BeWo細胞TEER無明顯影響（P＞0.05）。結(jié)論：妊娠早期絨毛組織中含有高濃度的E2，足月分娩時胎盤組織中E2相對較低；在體外實驗中，不同濃度雌激素可能影響胎盤滋養(yǎng)細胞連接功能的維持，5×10-7mol/L可作為E2處理BeWo細胞的有效濃度。

妊娠；絨毛膜絨毛；胎盤；雌二醇

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:298-301）

人類妊娠早期雌激素主要由卵巢黃體產(chǎn)生，妊娠9周以后胎盤利用來自母體和胎兒腎上腺的雄激素作為前體合成雌二醇（E2）取代黃體成為雌激素的主要來源［1］。胎盤中雌激素作用貫穿妊娠的各個階段，有研究提示非生理濃度雌激素環(huán)境與異常胎盤相關的妊娠期并發(fā)癥如子癇前期（PE）、胎兒生長受限（FGR）有關［2-4］。然而，胎盤中雌激素的確切功能仍不明確，甚至絨毛組織和胎盤組織中的雌激素水平及其變化規(guī)律亦未闡明?，F(xiàn)有的研究大多是關于孕婦外周血或臍血中的E2水平，或者是基于孕婦外周血中雌激素水平進行的滋養(yǎng)層細胞體外試驗［5］。組織中的激素合成與分泌、激素結(jié)合蛋白、受體、靶細胞構(gòu)成等機制，使組織中雌激素水平與外周血中激素水平不完全一致［6］。所以，直接測定絨毛組織和胎盤組織中的E2濃度，對闡明雌激素在胎盤形成、功能以及胎兒發(fā)育等過程中的作用非常重要。本研究檢測正常妊娠早期絨毛組織和足月妊娠胎盤組織中的E2水平，并用E2處理單層培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞系（BeWo細胞）觀察跨膜電阻（TEER）的變化，為今后體內(nèi)、體外研究雌激素對胎盤功能和胚胎發(fā)育作用提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2015年7月在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科足月分娩的孕產(chǎn)婦共20例，年齡25～41歲，孕38+3～39+6周，單胎，無妊娠期并發(fā)癥，因其他因素行擇期剖宮產(chǎn)手術分娩，而非子宮內(nèi)膜、胎盤發(fā)育、胎兒發(fā)育的原因。其他因素是指骨盆略小、身體較瘦弱、產(chǎn)婦嚴重怕疼、不具備無痛分娩條件等，這些因素對胎盤組織結(jié)構(gòu)與功能的影響小；而擇期剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦應激反應小、產(chǎn)程短而且更加可控，因而對胎盤組織中激素水平的影響小。新生兒出生體質(zhì)量（3 560± 545）g，Apgar評分為10分。另選擇同期本院計劃生育科因非意愿妊娠而行人工流產(chǎn)手術的患者共20例，年齡21～40歲，平均孕周為7.74（6.00～9.48）周，所有患者均通過術前B超確認為單胎妊娠，無胚胎停育，無其他妊娠相關合并癥。所有受試者均簽訂知情同意書，本研究方案得到本院倫理委員會批準。

1.2 標本的采集和處理

1.3 細胞培養(yǎng)和TEER檢測BeWo細胞（中國武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心）用10%胎牛血清（美國Cell Science公司）+90%F12K（美國Gibco公司）+10%青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，待細胞密度達到80%時，將細胞消化離心后用培養(yǎng)液重懸，濃度調(diào)制為5×105個/mL；Millicell培養(yǎng)小室中（美國Millipore公司）每孔滴細胞懸液500 μL，進行單層培養(yǎng)，方法參見文獻［13］。待BeWo細胞形成完整的單層細胞后，分別用含有0（對照），5×10-9，5×10-8，5×10-7mol/L E2（美國Sigma公司）的培養(yǎng)液培養(yǎng)1，3，6，12 h，每個時間點均用Millicell ESR-2（美國Millipore公司）測定其TEER。以上試驗使用不同批次細胞，重復3次。本研究比較的是以對照為基數(shù)（設定為1），不同E2處理濃度下TEER的相對表達倍數(shù)，而非TEER的具體數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用Student′s t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠早期和足月分娩患者血清、胎盤（絨毛）組織勻漿液中E2水平在妊娠早期，絨毛組織中有較高濃度的E2。妊娠早期孕婦外周血血清E2濃度低于足月妊娠孕婦，而孕婦絨毛組織E2濃度顯著高于足月妊娠孕婦胎盤組織，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。足月分娩時，新生兒臍動脈血清中E2濃度低于足月孕婦外周血清中E2濃度，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.3，P＜0.001）。見表1。

表1 2組患者血清、胎盤（絨毛）組織勻漿液中E2水平（±s）

表1 2組患者血清、胎盤（絨毛）組織勻漿液中E2水平（±s）

組別n外周血（nmol/L）胎盤（絨毛）（pmol/mg）臍動脈血（nmol/L）妊娠早期203.44±1.3030.82±13.91-足月分娩20509.78±197.8217.21±5.37137.41±44.43 t（P）10.2（＜0.001）4.1（＜0.001）-

2.2 不同濃度E2處理條件下滋養(yǎng)層細胞的TEER變化5×10-8mol/L和5×10-9mol/L的E2處理單層培養(yǎng)的BeWo細胞，各個時間點的TEER與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；5×10-7mol/L E2處理BeWo細胞12h，TEER較對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示細胞電勢能異常，BeWo細胞緊密連接受損，并因此影響細胞滲透性。見圖1。

圖1 不同濃度E2處理條件下，滋養(yǎng)層細胞跨上皮電阻

3 討論

在妊娠過程中，母體外周血E2水平穩(wěn)步上升，且妊娠中、晚期的升高速率遠高于妊娠早期，這是由于胎盤在妊娠期作為內(nèi)分泌器官向母體循環(huán)系統(tǒng)中分泌大量雌激素［6］；既往文獻報道在妊娠早期末，母體外周血中的E2由最初的0.34～0.45 nmol/L升至5～11 nmol/L，臨產(chǎn)前可達50～100 nmol/L［14-17］。本研究結(jié)論與文獻報道一致，確切數(shù)值略有差別，可能是由于檢測方法不同和病例數(shù)相對較少。

本研究結(jié)果顯示，妊娠早期的絨毛組織中E2水平顯著高于足月分娩胎盤組織中的E2水平，這與母親外周血E2水平的變化明顯不同。胎盤組織中的雌激素來源，除母體來源外，胎盤本身還能夠合成雌激素，且在妊娠9周以后成為母體（外周血中）雌激素的主要來源［1］。本研究中20例非意愿妊娠行早期流產(chǎn)者，平均孕周為7.74周，因此其絨毛組織中E2來源于母體和胎盤兩方面；同時，絨毛組織可能存在特殊的雌激素富集機制。本研究采用體外單層培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞系BeWo細胞，用5×10-9、5×10-8、5×10-7mol/L濃度的E2處理1，3，6，12 h，測定TEER以評估BeWo細胞間緊密連接的完整性，也說明在體外實驗中設計E2濃度的合理性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5×10-7mol/L E2處理Bewo細胞12 h后，TEER顯著降低，提示不同濃度的雌激素可能參與胎盤滋養(yǎng)細胞功能的維持和調(diào)節(jié)，在體外實驗中，5×10-7mol/L可作為處理BeWo細胞的有效濃度。

與妊娠早期絨毛組織相比，足月分娩胎盤組織中的E2水平降低。足月胎盤組織一方面合成雌激素逐漸下降，另一方面對E2的代謝更為旺盛，同時也說明足月分娩時胎盤功能對E2的依賴性有所下降。雌激素可促進胎盤血管生成，改變孕產(chǎn)婦心血管功能以適應妊娠狀態(tài)［18-20］，并對胚胎發(fā)育與成熟起重要作用［21］。胎盤組織中雌激素水平異常，可能與妊娠期并發(fā)癥有關，如PE、FGR、新生兒低體質(zhì)量的風險增加。研究表明，胚胎植入、胎盤形成和成熟時的非生理劑量雌激素環(huán)境，可能通過影響滋養(yǎng)層細胞的侵襲功能，并使胎盤血管重塑受限，繼而出現(xiàn)胎盤缺血、缺氧，導致胎盤功能異常，最終導致不良妊娠結(jié)局［22-24］。通過體內(nèi)、體外試驗，研究雌激素對胎盤結(jié)構(gòu)和功能的影響，對研究諸如PE、子癇、FGR等妊娠病理也是必要的。

綜上所述，本研究直接測定了正常自然妊娠女性妊娠早期絨毛組織和足月分娩胎盤組織中的E2水平，并在體外單層培養(yǎng)的BeWo細胞上初步探討E2的作用。妊娠早期絨毛組織中含有高濃度的E2，足月分娩時胎盤組織中E2相對較低；在體外實驗中，不同濃度的雌激素可能參與胎盤滋養(yǎng)細胞功能的維持和調(diào)節(jié)，5×10-7mol/L可作為E2處理BeWo細胞的有效濃度。

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Placental and Villous Concentrations of Estradiol in the Pregnancy and Its Significance

LIU Jie，ZHANG Yuan，CUI Yu-gui，

GAO Li，GONG Yi-ming，LIU Jia-yin.Clinical Center of Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ZHANG Yuan，E-mail:zhangyuan_ccrm@126.com；LIU Jia-yin，E-mail:jyliu_nj@126.com

Objective:To test estradiol（E2）levels in the maternal peripheral blood，villi and placenta in the first trimester and term parturition，as well as the estradiol level of umbilical artery blood in term delivery.Culture trophoblast cell line BeWo in vitro to investigate the role of E2.Methods:This study included 20 unwilling pregnant women who want to have early artificial abortion and 20 pregnant women of full term cesarean delivery.The levels of E2in the tissues of early abortion，peripheral blood of pregnant women and umbilical artery blood，placenta tissue of the women during labor were measured by chemiluminescence immunoassay（CLIA）.After BeWo cells in monolayer culture，those cells were treated with E2of 0 mol/L，5×10-7mol/L，5×10-8mol/L and 5×10-9mol/L for 1，3，6 and 12 h，and then transepithelial resistance（TEER）was measured by millicell ESR-2 to observe the integrity of the tight junctions between BeWo cells.Results:E2were lower in peripheral plasma from early pregnancy［（3.44±1.30）nmol/L］compared with that from third trimesters［（509.78±197.82）nmol/L］（t=10.2，P＜0.001）.However，E2were higher in tissue obtained from villus［（30.82±13.91）pmol/mg］than that from third trimesters placenta［（17.21±5.37）pmol/mg］（t= 4.1，P＜0.001）.A decrease of TEER was observed after the treatmeat of E2at a concentration of 5×10-7mol/L for 12 hours（P＜0.05）.The other two concentrations，5×10-8mol/L and 5×10-9mol/L，had no significant effect on the TEER of BeWo cells at all time points（P＞0.05）.Conclusions:The concentrations of E2in villus obtained from first trimester is higher；E2in full-term birth placenta tissues is relatively lower；In vitro，different concentrations of E2may affect the maintenance of junction between trophoblast cells，5×10-7mol/L can be used as the effective concentrations of estradiol to treat with BeWo cells.

Pregnancy；Chorionic villi；Placenta；Estradiol

2015-11-28）

［本文編輯 王昕］

國家自然科學基金（81401265）；國家973項目（2012CB944902，2012CB944703）；江蘇省自然科學青年基金（BK20141025）

210029南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科

張園，E-mail：zhangyuan_ccrm@126.com；劉嘉茵，E-mail：jyliu_nj@126.com