柳　林，韋術敏，程仕偉，高美玲，孫虎山（魯東大學 生命科學學院，應用生物技術山東省高校重點實驗室，山東 煙臺 264025）

產(chǎn)膠原酶的琥珀葡萄球菌分離鑒定及其培養(yǎng)優(yōu)化研究

柳林，韋術敏，程仕偉，高美玲，孫虎山*
（魯東大學 生命科學學院，應用生物技術山東省高校重點實驗室，山東 煙臺 264025）

針對膠原蛋白難消化利用的現(xiàn)狀，自煙臺近海分離篩選產(chǎn)膠原蛋白降解酶的微生物，獲得高產(chǎn)菌株SM 12，并經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S rDNA鑒定，確定菌株SM 12為琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）。通過單因素試驗確定最佳培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件為20 g/L葡萄糖，15 g/L牛肉膏，20 g/LNaCl，10 g/L明膠，初始pH 7.5，培養(yǎng)溫度37℃，接種量7.5%（V/V），裝液量100m L/500m L。在此最佳條件下，篩選的菌株SM 12在發(fā)酵24 h后獲得最大膠原酶活力185.32 U/m L，具備在水產(chǎn)加工下腳料高值化加工領域的應用潛力。

膠原蛋白；膠原酶；琥珀葡萄球菌；發(fā)酵條件優(yōu)化

膠原蛋白具有獨特的超螺旋結(jié)構（3條α肽鏈的右手螺旋），性質(zhì)穩(wěn)定，一般加工溫度及短時間加熱都不能使其分解，不易被人體吸收利用［1-3］。而將膠原蛋白水解為膠原多肽，具有易吸收、抗?jié)?、抗過敏、降血壓、抗菌、抗氧化、降膽固醇、抗衰老、促進傷口愈合、預防骨質(zhì)疏松及關節(jié)炎、促進角膜上皮損傷修復等多種生理活性［4-6］，使得膠原多肽成為膠原蛋白高值化利用的研究熱點［7-9］。

膠原酶是一種水解天然膠原的蛋白水解酶，能在適當?shù)膒H值和溫度下只切割活性膠原螺旋區(qū)或明膠而不作用于其他蛋白底物。膠原酶的降解活力、穩(wěn)定性等因素成為高效利用膠原蛋白關鍵［10］。膠原酶按照其來源可分為植物膠原酶、動物膠原酶和微生物膠原酶，其中細菌來源膠原酶可以分泌到細胞外，通過發(fā)酵大量獲得，因此微生物來源的膠原酶在應用方面更加廣泛。

目前研究最多的微生物膠原酶源于溶組織梭狀芽孢桿菌（Clostridium histo lyticum），但其為病原菌，伴有毒素產(chǎn)生，并非理想的膠原酶來源［11-12］?；谀壳八a(chǎn)加工企業(yè)產(chǎn)生大量魚皮下腳料的現(xiàn)狀，本研究以選育產(chǎn)膠原酶創(chuàng)新菌株為重點，確定菌屬來源并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，期望獲得容易培養(yǎng)且非病原菌、降解效果高效的膠原酶生產(chǎn)菌，實現(xiàn)魚皮等下腳料的高值化利用。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1品

樣品采自養(yǎng)馬島、海濱浴場、芝罘島和第一海水浴場中有機質(zhì)豐富的水土混合樣。

1.1.2學試劑

膠原蛋白、還原茚三酮、水合茚三酮：上海生工生物工程有限公司；DNA標準品、脫氧核糖核苷三磷酸、PCR引物、Taq PlusDNA聚合酶：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：明膠20 g/L，酵母粉3 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO40.1 g/L，pH 7.0。

復篩培養(yǎng)基：明膠10 g/L，酵母粉15 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl5 g/L，pH 6.5。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源10g/L，牛肉膏10g/L，明膠10 g/L，NaCl5 g/L，pH 7.0。

上述培養(yǎng)基均用陳海水配制。

1.2器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通儀器有限公司；SWCJ-1B超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；H1850R離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HZQ-Q全溫搖床：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；L96G型PCR分析儀：杭州朗基科學儀器有限公司。

1.3驗方法

1.3.1株篩選

收集含有豐富有機質(zhì)的海水淤泥，梯度稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至長出單菌落，觀察并挑取產(chǎn)生透明圈的菌株。篩選的菌株接種于復篩培養(yǎng)基中，在28℃和180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心10min，取上清液測定酶活。

1.3.2屬鑒定

單菌落形態(tài)觀察，經(jīng)簡單染色、革蘭氏染色和芽孢染色后鏡檢。生理生化鑒定方法參照《工業(yè)微生物實驗技術》［13］。

提取的菌株基因組脫氧核糖核酸（deoxyribosenucleic acid，DNA），以16SrDNA的聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction，PCR）通用引物進行擴增（16S-FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16S-RAAGGAGGTGATCCAGCCGCA），PCR程序設定：預變性95℃、5min，循環(huán)95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，35個循環(huán)，延伸10m in。電泳檢測，切膠測序。將獲得序列提交美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），通過Blast進行同源性比較，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3酵條件優(yōu)化

將菌種液體活化后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，設定碳源、氮源、金屬鹽、初始pH值、培養(yǎng)溫度、裝液量和接種量為其中一變量，進行種類和濃度梯度優(yōu)化，在一定培養(yǎng)組分和條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定酶活。確定優(yōu)化發(fā)酵條件后，測定產(chǎn)膠原酶的培養(yǎng)曲線，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.3.4原酶活力的測定

1mg膠原蛋白用0.5m L磷酸緩沖液溶解（pH7.4），加入0.1m L酶液，37℃反應40min。加10%三氯乙酸0.5m L終止反應，再加入0.9m L乙酸緩沖液（pH 5.4）和1m L茚三酮顯色液混勻。100℃水浴加熱10m in，冷卻后用3m L的體積分數(shù)60%乙醇稀釋。在570 nm波長條件下比色測定。對照組：為消除干擾，首先取0.1m L的酶液在100℃水浴煮沸10min將酶進行滅活，其余步驟同酶活力測定。以每1m L酶液水解膠原蛋白每1m in生成1μg的甘氨酸的量為一個酶活力單位（U）［14］。為直觀顯示培養(yǎng)因素對膠原酶活力的影響，優(yōu)化過程采用相對酶活力指標，其計算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1原酶產(chǎn)生菌篩選

自煙臺地區(qū)養(yǎng)馬島、海濱浴場、芝罘島和第一海水浴場的水土混合樣中分離獲得產(chǎn)生明膠降解圈的菌株52株，對透明圈與菌落直徑比數(shù)值大的部分菌株進行膠原酶活力測定，結(jié)果見表1。由表1可以看出，分離自養(yǎng)馬島海域的菌株SM 12產(chǎn)膠原酶活力最高，為33.63U/m L，故將其作為后續(xù)研究的菌株。

表1　部分菌種產(chǎn)膠原酶活力Table 1 Collagenase activity of a part of strains

2.2株SM 12的顯微形態(tài)

對純化后的菌株SM 12進行簡單染色及革蘭氏染色，觀察其顯微形態(tài)，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株SM 12的顯微形態(tài)Fig.1 Micromorphology of strain SM12

由圖1可知，高膠原酶活力的產(chǎn)生菌株SM 12在固體平板培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形且中央凸起，白色，表面干燥，周圍粗糙，不透明也無光澤。顯微觀察呈現(xiàn)球狀但是不成鏈，革蘭氏陽性菌。

2.3株SM 12的生理生化試驗

表2　菌株SM 12的生理生化試驗結(jié)果Table 2 Results ofphysiologicaland biochemical tests of strain SM 12

菌株SM 12的生理生化試驗結(jié)果見表2。由表2可知，生理生化測定發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)淀粉酶，分解葡萄糖產(chǎn)酸，能使明膠液化，在質(zhì)量分數(shù)20%鹽度條件下仍能生長，在4℃和50℃培養(yǎng)溫度下未見生長，不能利用棉子糖，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，該菌株具備葡萄球菌屬的生化特征。

2.4株SM 12的分子生物學鑒定

以菌株SM 12的總DNA為模板，采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，檢驗得到一條1 414 bp的條帶。切膠測序得16S rDNA序列，去掉雜峰區(qū)序列后的800 bp在NCBI上同源性比較，同源性較高的為琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus），同源性＞99%。采用MEGA6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。

圖2菌株SM 12的16S rDNA的PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of16S rDNA PCR amplified ofstrain SM 12

圖3 菌株SM 12 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain SM 12

細菌分類學家認為當16S rDNA的同源性＞97%時屬內(nèi)同種，＜95%則是外成員。綜合其形態(tài)與分子鑒定結(jié)果，將菌株SM 12鑒定為琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）。琥珀葡萄球菌是腌制食物中的常見菌，尚未見致病性和生產(chǎn)膠原酶的相關報道，具有生產(chǎn)膠原酶潛力。

2.5養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.5.1源及添加量對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

選用葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘油、糊精、蔗糖、淀粉和麥芽醇，添加量均為10 g/L，考察碳源種類對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，最佳產(chǎn)膠原酶相對酶活力的碳源為葡萄糖，其次為麥芽糖、甘油和果糖，而蔗糖、淀粉和甘露醇為碳源時膠原酶的相對酶活力較低。因此，選擇葡萄糖為最適碳源。

圖4　碳源對相對酶活力的影響Fig.4 Effecto f carbon source on the relative enzyme activity

圖5　葡萄糖質(zhì)量濃度對相對酶活力的影響Fig.5 Effectof glucose concentration on the re lative enzyme activity

葡萄糖質(zhì)量濃度對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度增加，膠原酶活力增加，當葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時膠原酶活力達到峰值，相對酶活力為100%。此后隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，膠原酶的活力開始緩慢降低。因此，選擇葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L為宜。

2.5.2源及添加量對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

不同氮源對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖6，氮源添加量為10 g/L。由圖6可知，最佳產(chǎn)酶氮源為牛肉膏，其次為速效氮源（尿素、硫酸銨和氯化銨）。因此，選擇牛肉膏為最適氮源。

圖6　氮源對相對酶活力的影響Fig.6 Effec t of nitrogen source on the rela tive enzym e ac tivity

牛肉膏質(zhì)量濃度對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中牛肉膏質(zhì)量濃度的增加，膠原酶的活力持續(xù)增加，并在牛肉膏質(zhì)量濃度15 g/L時獲得最大膠原酶活力，相對酶活力為100%。此后牛肉膏質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，膠原酶的活力開始快速降低，故最佳牛肉膏質(zhì)量濃度為15 g/L。

圖7　牛肉膏質(zhì)量濃度對產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響Fig.7 Effec t of beef extract content on the relative enzyme activity of collagenase

2.5.3屬離子及添加量對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

在金屬鹽添加量均為8 g/L時，金屬鹽種類對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知，產(chǎn)酶活力最高的金屬鹽為NaCl，其次為ZnSO4，這與以往報道膠原酶催化中心位點具有Zn2+存在一定相關性［15］。

圖8　金屬鹽對相對酶活力的影響Fig.8 Effectofmetalsalton the relative enzyme activity

鑒于產(chǎn)膠原酶的琥珀葡萄球菌SM 12分離自海洋樣品，且在多數(shù)腌制食品中均有該菌的發(fā)現(xiàn)，故該菌株對金屬鹽應有一定耐受性。NaCl質(zhì)量濃度對產(chǎn)膠原酶的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度上升，相對酶活力逐漸增加，并在NaCl質(zhì)量濃度20 g/L時獲得最大相對酶活力，且在NaCl質(zhì)量濃度10～30 g/L區(qū)間內(nèi)相對酶活差異不顯著。因此，最佳的NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖9　NaC l質(zhì)量濃度對相對酶活力的影響Fig.9 Effectof NaClcontenton the relative enzyme activity

2.6養(yǎng)條件優(yōu)化

2.6.1同初始pH對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

在最佳培養(yǎng)基條件（20g/L葡萄糖，15g/L牛肉膏，20 g/L NaCl，10 g/L明膠）下，考察不同初始pH對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖10。由圖10可知，在初始pH值為7.5時，即略偏堿性條件下產(chǎn)膠原酶相對酶活力最高。

圖10　初始pH對相對酶活力的影響Fig.10 Effectof initialpH on the relative enzyme activity

2.6.2不同裝液量對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

在最佳培養(yǎng)基條件下，考察不同裝液量對菌株SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖11。由圖11可知，相對酶活隨裝液量的增加中于先增大后減小的趨勢，裝液量為100m L/500m L時，獲得最大相對酶活力，最佳裝液量為100m L/500m L。50m L/500m L裝液量的產(chǎn)酶活力與100m L/500m L裝液量時情形接近，故菌株SM 12對氧有一定趨向需求，在發(fā)酵放大過程中應考慮，選擇裝液量為100m L/500m L。

圖11　裝液量對相對酶活力的影響Fig.11 Effec t of liquid volume on relative enzym e ac tivity

2.6.3同接種量對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

在最佳培養(yǎng)基條件下，考察不同接種量對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖12。由圖12可知，接種量為7.5%（V/V）時，獲得最大相對酶活力。接種量太低或太高均不利于膠原酶的產(chǎn)生，原因在于接種量太低造成發(fā)酵時間延長，而接種量過高會使得菌種提前老化衰退。因此，最佳接種量為7.5%（V/V）。

圖12　接種量對相對酶活力的影響Fig.12 Effectof inoculum on the relative enzyme activity

2.6.4同培養(yǎng)溫度對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響

在最佳培養(yǎng)基條件下，考察不同培養(yǎng)溫度對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶相對酶活力的影響，結(jié)果見圖13。由圖13可知，培養(yǎng)溫度為37℃時，獲得最大相對酶活力。在28～37℃的溫度區(qū)間的產(chǎn)酶量均較高且差異不明顯，而培養(yǎng)溫度超過37℃后酶產(chǎn)量迅速降低，可能由于溫度過高造成酶失活。因此，最佳產(chǎn)膠原酶的培養(yǎng)溫度為37℃。

2.7珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的培養(yǎng)時間曲線

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件：20 g/L葡萄糖，15 g/L牛肉膏，20 g/L NaCl，10 g/L明膠，pH 7.5，溫度37℃，接種量7.5%（V/V），裝液量100m L/500m L瓶，考察不同培養(yǎng)時間對琥珀葡萄球菌SM 12產(chǎn)膠原酶的影響，結(jié)果見圖14。

圖13　培養(yǎng)溫度對相對酶活力的影響Fig.13 Effectof culture temperature on the relative enzyme activity

圖14　琥珀葡萄球菌SM12產(chǎn)膠原酶的培養(yǎng)曲線Fig.14 Culture curve of S.succinus SM 12 for the co llagenase production

由圖14可知，隨著菌體的快速增殖，膠原酶活性迅速增加，在發(fā)酵24 h后獲得最大酶活性（185.32U/m L）。隨著發(fā)酵時間延長，當超過24 h時酶活呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，且在35～60 h區(qū)間下降緩慢。從發(fā)酵曲線看，進入微生物培養(yǎng)靜止期后酶活性變化不大，菌株SM 12的產(chǎn)酶模式可能是生長偶聯(lián)型，相關培養(yǎng)工藝還有待深入優(yōu)化。

3　結(jié)論

自煙臺近海海域的采集樣品中分離篩選到高產(chǎn)膠原酶菌株SM 12，經(jīng)形態(tài)、生理生化和分子鑒定確定為琥珀葡萄球菌（Seaphylococcus succinus）。在此基礎上，優(yōu)化碳源、氮源、金屬鹽、初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量對產(chǎn)膠原酶的影響，確定最佳培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件為20 g/L葡萄糖，15 g/L牛肉膏，20g/LNaCl，10 g/L明膠，初始pH值7.5，溫度37℃，接種量7.5%（V/V），裝液量100m L/500m L。在優(yōu)化條件下發(fā)酵24 h獲得最大酶活力為185.32U/m L。

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Isolation and identification and culture optimization of Staphyloccus succinus for the collagenase profuction

LIU Lin，WEIShum in，CHENG Shiw ei，GAOMeiling，SUN Hushan*
（Key Laboratory ofApplied Biotechnology in Shandong Province，College ofLife Science，Ludong University，Yantai264025，China）

To solve the situation thatcollagen was difficult to be digested and utilized，them icroorganism which produce collagen degradation enzyme was isolated and screened from the Yantaioffshore，thehigh-yielding strain SM 12wasobtained and determ ined as Staphylococcussuccinus bymorphologic observation，physiologicalbiochemical testsand 16S rDNA identification.By single factor experiments，the optimum medium components and fermentation conditionswas determined as follows:glucose 20 g/L，beef extract 15 g/L，NaCl20 g/L，gelatin 10 g/L，pH 7.5，37℃，inoculum 7.5%（V/V）and liquid volume 100m l/500m l.Under the optimum conditions，the collagenase activity of strain SM 12 screened was themaximum 185.32U/m lat fermentation time24 h.Thestrain had thepotentialapplications in high valueprocessing foraquatic productsprocessingwaste.

collagen protein；collagenase；Staphylococcussuccinus；fermentation conditionsoptim ization

Q815

0254-5071（2016）01-0062-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．014

2015-10-26

應用生物技術山東省高校重點實驗室開放課題（KLABU-2014-01）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201410451010，201510451064），魯東大學學生創(chuàng)新課題（ld151053）

柳林（1989-），男，碩士研究生，研究方向為生物技術。

孫虎山（1962-），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治。