邢竹青，王彥寧，劉兆賢，鄔亞男，梁　麗，王艷萍（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

Lactobacilluskefiranofaciens乳糖酶基因克隆及在畢赤酵母中表達(dá)

邢竹青，王彥寧，劉兆賢，鄔亞男，梁麗，王艷萍*
（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

以馬乳酒樣乳桿菌ZW3基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到乳糖酶中LacL、LacM兩個(gè)大小亞基片段，經(jīng)EcoRI和SnaBI雙酶切后，分別連接pPIC9K質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并驗(yàn)證其核苷酸序列正確。將重組質(zhì)粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，構(gòu)建pPIC9K-LacL-GS115重組子和pPIC9K-LacM-GS115重組子，通過篩選得到抗G418濃度達(dá)到3.0mg/m L，具有多拷貝基因的重組子。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證，cDNA上存在LacL片段，并可檢測(cè)到乳糖酶酶活達(dá)到1.17 U/m L；pPIC9K-LacM-GS115重組子誘導(dǎo)表達(dá)72 h后的發(fā)酵液上清經(jīng)SDS蛋白電泳檢測(cè)到目的條帶。

乳糖酶；畢赤酵母；克??；表達(dá)

乳糖酶水解乳糖的糖苷鍵分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，或發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷作用生成低聚半乳糖［1］。主要用于生產(chǎn)低乳糖牛奶以緩解乳糖不耐受癥，近年來其在保健食品生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用也備受關(guān)注（如低聚半乳糖［2］），其市場(chǎng)需求量逐年擴(kuò)大。因此，對(duì)乳糖酶的研究不僅具有理論意義，而且有巨大的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

乳酸菌被公認(rèn)為一般安全（generally recognizedassafe，GARS）食品，是應(yīng)用于食品工業(yè)中的重要菌種［3］。乳酸菌來源的乳糖酶為中性乳糖酶［4］，其最適溫度介于40～60℃，可滿足乳制品生產(chǎn)的要求，但其不能胞外分泌，提高了分離純化的難度，不適宜實(shí)際食品工業(yè)生產(chǎn)。為了獲得具有大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的重組酶發(fā)酵菌株，一株經(jīng)過全基因組測(cè)序的馬乳酒樣乳桿菌ZW 3［5］中兩個(gè)含有重疊區(qū)域的LacL、LacM乳糖酶大小亞基片段分別被克隆到高效的蛋白表達(dá)平臺(tái)——畢赤酵母［6］中，進(jìn)行了初步表達(dá)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1種

馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacilluskefiranofaciens）ZW 3，大腸桿菌DH5α，畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115，以上菌種均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2養(yǎng)基［6-7］

LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、MD培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基（m inimalmedium，MM）、BMGY誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基、BMMY誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基。

1.1.3粒

酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K：由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4物

基因Lac L和LacM引物：根據(jù)大小亞基基因片段的核酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物添加限制性內(nèi)酶位點(diǎn)SnaB I，下游引物添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoR I。

Lac L F 5′-CGGTACGTAATGCAAGCAAATATTAA ATG-3′

Lac L R 5′-CGCGGGAATTCTTATTTGTGTAATCC ATAATAG-3′

Lac M F 5′-CCGTACGTAATGGATTACACAAATA AG-3′

LacM R 5′-CGGAATTCTTAAAACTGGTTTAAGAT GAAGG-3′

pPIC9K載體測(cè)序通用引物：

5′AOX1 5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′

3′AOX1 5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′

1.1.5要試劑

限制性內(nèi)切酶SnaB I及EcoR I、T4連接酶、Fastpfu高保真聚合酶、細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、β-半乳糖苷酶試劑盒。

1.2器與設(shè)備

genepulser Xcell電轉(zhuǎn)儀、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Power PAC 3000電泳儀、全自動(dòng)凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；DYY-Ⅲ-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ-24D型電泳槽：北京六一儀器廠；5415D型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AD07R-20-A12E循環(huán)水浴鍋：美國Polyscience公司；VIS-7220型分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司。

1.3法

1.3.1色體的提取

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取馬乳酒樣乳桿菌ZW 3染色體。

1.3.2糖酶大、小亞基基因片段的擴(kuò)增

以馬乳酒樣乳桿菌ZW 3染色體為模板、LacL F、LacL R、LacM F、LacM R為引物，以常規(guī)方法擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2m in，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10m in。

1.3.3別構(gòu)建pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM重組質(zhì)粒

擴(kuò)增所得的大、小亞基片段進(jìn)行SnaB I和EcoR I雙酶切，分別與經(jīng)過相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后的pPIC9K質(zhì)粒，在T4連接酶的作用下，16℃進(jìn)行連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)細(xì)胞DH5α，驗(yàn)證陽性的克隆，送華大生物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.4Pichia pastorisGS115感受態(tài)制備

參照參考文獻(xiàn)［7］。

1.3.5化Pichia pastoris GS115

參照《分子克隆指南》酵母電轉(zhuǎn)化方法［8］。

1.3.6赤酵母重組子總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

Trizol法［9］提取畢赤酵母重組子總RNA，以提取到的總RNA作為模板利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA。

1.3.7糖酶酶活力的測(cè)定

使用β-半乳糖苷酶試劑盒測(cè)定，按照說明書操作。單位的定義：每1m L發(fā)酵上清液每小時(shí)產(chǎn)生1 nmol對(duì)硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位，U/m L。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增馬乳酒樣乳桿菌乳糖酶基因

在NCBI中查找馬乳酒樣乳桿菌ZW 3全基因組序列上乳糖酶基因LacLM，全長2 833 bp，由大小兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中大亞基LacL全長1 884 bp，小亞基LacL全長960 bp，二者有重疊區(qū)域。利用BLAST軟件進(jìn)行蛋白相似性比對(duì)，可知與LacL蛋白相似性最高的序列為瑞士乳桿菌中的乳糖酶大亞基，相似度達(dá)到82%；與LacM蛋白相似性最高的序列為瑞士乳桿菌中的乳糖酶小亞基，相似度達(dá)到81%。因?yàn)楫叧嘟湍副磉_(dá)載體pPIC9K已經(jīng)帶有信號(hào)肽序列，所以不需要添加信號(hào)肽。PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）所示，產(chǎn)物分別在不到1 000 bp處和接近2 000 bp處有兩條單一條帶，圖1中顯示的結(jié)果與理論大小一致。

圖1　乳糖酶基因LacL、LacM PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram of PCR amp lification products of lactase gene LacL and LacM

2.2組載體的驗(yàn)證

提取重組子中質(zhì)粒，進(jìn)行SnaB I和EcoR I雙酶切驗(yàn)證，重組載體斷為兩條帶。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，大于8 000 bp的條帶為pPIC9K載體片段，接近2 000 bp的片段為LacL片段，接近1 000 bp的片段為LacM片段，與目標(biāo)條帶大小一致。重組子質(zhì)粒經(jīng)過通用引物5’AOX1和3’AOX1測(cè)序后，與馬乳酒樣乳桿菌ZW 3基因組上大、小亞基片段的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果相似性為100%，說明所得大、小亞基的核苷酸序列完全正確。

圖2　重組pPIC9K-LacL質(zhì)粒（A）和重組pPIC9K-LacM質(zhì)粒（B）驗(yàn)證結(jié)果Fig．2 Verification results of recom binant p lasm id pPIC9K-LacL（A）and pPIC9K-LacM（B）

2.3組質(zhì)粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115

重組質(zhì)粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分別電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Pichiapastoris GS115。轉(zhuǎn)化子經(jīng)MM/MD平板篩選后，挑選His+Mut+表型的酵母重組子，利用通用引物5’AOX1和3’AOX1進(jìn)行驗(yàn)證。由圖3（A）可知，1-7泳道均出現(xiàn)兩條帶，一條為AOX 1基因的2.2 kbp條帶，另一條為目的條帶大小，接近2 000 bp，與LacL片段大小一致。圖3（B）中，2和3泳道只有目的基因一條帶，說明AOX1基因在整合過程中被破壞，該重組子為假陽性；另外4個(gè)泳道，均出現(xiàn)兩條帶，一條為AOX1基因的2.2 kbp條帶，另一條為目的條帶，大小接近1 000 bp，與LacM片段大小一致。從而證明，LacL與LacM基因已分別成功整合到Pichia pastoris GS115基因組中。

圖3 pPIC9K-Lac L酵母重組子（A）和pPIC9K-LacM酵母重組子（B）PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig．3 PCR verification resu lts of yeast recombinant pPIC9K-LacL（A）and pPIC9K-LacM（B）

2.4拷貝重組子的篩選

pPIC9K質(zhì)粒整合在酵母染色體中，能夠使細(xì)胞產(chǎn)生G418抗性，其G418抗性水平與整合的卡那霉素抗性基因拷貝數(shù)直接相關(guān)，可進(jìn)行體內(nèi)多拷貝整合的篩選。分別取菌體細(xì)胞依次點(diǎn)接于含不同質(zhì)量濃度（0.50mg/m L、1.00mg/m L、2.00mg/m L、3.00 mg/m L）G418抗性平板上。以pPIC9KLacL-GS115酵母重組子為例，30℃培養(yǎng)2～5 d，挑取4株在質(zhì)量濃度為3.00mg/m L的G418抗性平板上生長較好的菌落，作為乳糖酶誘導(dǎo)表達(dá)的待選菌株，同樣方法選取4株pPIC9K-LacM-GS115酵母重組子，作為待選菌株。

2.5亞基LacL與小亞基LacM分別在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

將上述待選菌株接種于含有G418抗性的25m L BMGY培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以轉(zhuǎn)化pPIC9K空載體的畢赤酵母GS115菌株作為對(duì)照。再轉(zhuǎn)接于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中至OD600值為1.0～2.0，30℃振蕩培養(yǎng)，開始誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇使其最終體積分?jǐn)?shù)為0.5%以維持誘導(dǎo)。將選取的pPIC9K-LacL-GS115重組子和pPIC9K-LacM-GS115重組子各4株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，取培養(yǎng)72 h后的發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖4所示，4株pPIC9K-LacM-GS115重組子在約40 ku左右均有1條特異蛋白條帶，與預(yù)期得到帶有信號(hào)肽的目標(biāo)蛋白分子量相一致；在＞40 ku處也出現(xiàn)一條特異性條帶，通過NetNGlyc 1.0服務(wù)器分析，可知乳糖酶LacM氨基酸序列有一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，由此推測(cè)由于部分蛋白經(jīng)過糖基化修飾，導(dǎo)致分子量偏大。而在圖4中pPIC9K-LacL-GS115 4株重組子在80 ku處無明顯可見特異性蛋白條帶，這可能是由于表達(dá)量偏低，條帶不易檢測(cè)。

圖4　重組子誘導(dǎo)表達(dá)蛋白電泳圖Fig．4 Electrophoretogram of inducible expression protein by recombinant

圖5 酵母重組子RNA提取結(jié)果Fig．5 RNA extraction resultof yeast recombinant

為了檢測(cè)pPIC9K-LacL-GS115重組子中的LacL片段是否進(jìn)入到轉(zhuǎn)錄階段，提取重組子總RNA（如圖5），通過反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA作為模板，以LacL片段的特異引物進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證插入的LacL片段是否有相應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄（如圖6）。由圖5可知，LacL片段在pPIC9K-LacL-GS115重組子中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄過程，經(jīng)過稀有密碼子軟件［10］分析發(fā)現(xiàn)編碼LacL大亞基片段的基因序列在畢赤酵母中翻譯時(shí)有12個(gè)氨基酸的密碼子使用頻率低于10%，故推測(cè)是翻譯過程效率較低，導(dǎo)致蛋白表達(dá)量低。

圖6 cDNA PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 cDNA PCR identification result

現(xiàn)有研究顯示不同來源的乳糖酶基因在相似條件下經(jīng)甲醇誘導(dǎo)在畢赤酵母中表達(dá)，重組酶酶活水平在0.37～51.2U/m L［11-12］，本實(shí)驗(yàn)中pPIC9K-LacL-GS115重組子誘導(dǎo)表達(dá)72 h后的發(fā)酵液上清乳糖酶酶活達(dá)到1.17 U/m L，陰性對(duì)照組pPIC9K-GS115重組子甲醇誘導(dǎo)后未能檢測(cè)到乳糖酶活力，而pPIC9K-LacM-GS115重組子發(fā)酵72 h后的上清液未能測(cè)出乳糖酶酶活，這可能是由于其在畢赤酵母中糖基化后改變構(gòu)象造成的。另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［13-15］，LacL和LacM二者多以異源二聚體的形式發(fā)揮較高的乳糖酶活性。

3　結(jié)論

目前工業(yè)化生產(chǎn)使用的乳糖酶多來源于克魯維酵母，生產(chǎn)過程中必須經(jīng)過破壁提取酶蛋白，造成乳糖酶收率低，影響酶活力［16］。利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行外源分泌表達(dá)，可使酶直接分泌于胞外，簡化工藝步驟，減少酶活損失。本文采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組乳糖酶的表達(dá)，成功將馬乳酒樣乳桿菌ZW 3中乳糖酶大小亞基進(jìn)行克隆，并分別連接到高效表達(dá)載體pPIC9K上，整合至畢赤酵母GS115中。重組菌株對(duì)G418的抗性越強(qiáng)表明外源基因整合的拷貝數(shù)越高［17］，實(shí)驗(yàn)中成功篩選出高拷貝的pPIC9K-LacLGS115重組子和pPIC9K-LacM-GS115重組子。pPIC9KLacM-GS115重組子誘導(dǎo)表達(dá)72 h后的發(fā)酵上清液中檢測(cè)到目的蛋白LacM相應(yīng)條帶，并且測(cè)定出pPIC9K-LacLGS115重組子誘導(dǎo)表達(dá)72 h后的發(fā)酵上清液中乳糖酶酶活達(dá)到1.17U/m L。本研究在畢赤酵母中成功表達(dá)了來自馬乳酒樣乳桿菌ZW 3中的乳糖酶大小亞基，為其應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning of Lactobacillus kefiranofaciens β-galactosidase genes and expression in Pichia pastoris

XING Zhuqing，WANG Yanning，LIU Zhaoxian，WU Yanan，LIANG Li，WANG Yanping*
（College ofFood Engineeringand Biotechnology，Tianjin University ofScience&Technology，Tianjin 300457，China）

Using kum iss Lactobacillus kefiranofaciens ZW 3 genome as template，theβ-galactosidase genes（LacL and LacM）were am plified from L. kefiranofaciens by PCR，and itwas recombined into vector pPIC9K after digestion by EcoRIand SnaBI.Then two plasm ids of pPIC9K-LacL and pPIC9K-LacM were constructed through transformation into Escherichia coli DH5αand the nucleic acid sequencewasverified by sequencing results. The recombinationsof pPIC9K-LacL-GS115 and pPIC9K-LacM-GS115 were constructed by electroporating the vectors into Pichia pastoris GS115. Through screening，themulti-copy recombinations pPIC9K-LacL-GS115 and pPIC9K-LacM-GS115 were obtained resistant to 3.0 mg/m l G418. Through reverse PCR verification，LacL genes in recombination pPIC9K-LacL-GS115 were detected，in which fermented for 72 h induced by methanol.Moreover，theactivity ofβ-galactosidase from recombination pPIC9K-LacL-GS115 reached to 1.17 U/m l.A lso，the targetprotein band of recombination pPIC9K-LacM-GS115wasobserved by SDS-PAGE.

β-galactosidase；Pichia pastoris；clone；expression

Q556

0254-5071（2016）01-0010-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．003

2015-11-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171629）；天津科技大學(xué)大學(xué)生實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新基金項(xiàng)目（1414A303）

邢竹青（1989-），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

王艷萍（1962-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。