陳小雪，陳晶瑜，韓北忠（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

食品加工過(guò)程中細(xì)菌生物被膜的危害及控制

陳小雪，陳晶瑜，韓北忠*
（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

生物被膜中的微生物生活在一個(gè)由胞外聚合物（EPS）形成的環(huán)境中，它的形成是微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)保護(hù)模式，允許細(xì)胞在惡劣的環(huán)境中生存并分散到新的環(huán)境中。食品加工過(guò)程中有害菌形成的生物被膜對(duì)食品工業(yè)的危害極大，可使微生物殘存增加，加工設(shè)備無(wú)法嚴(yán)格清洗、消毒，導(dǎo)致產(chǎn)品受到污染。該文在收集、研究現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上歸納介紹了生物被膜的特點(diǎn)及其形成過(guò)程和形成機(jī)制，概述了生物被膜的危害、控制及檢測(cè)方法，旨在提高人們對(duì)生物被膜的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)該領(lǐng)域的研究發(fā)展。

細(xì)菌生物被膜；形成；食品加工；危害；調(diào)控機(jī)制

Keywors: bacterialbiofilm；formation；food processing；hazards；regulatorymechanism

近年來(lái)，由于生物被膜導(dǎo)致的安全問(wèn)題越來(lái)越多的被報(bào)道，它嚴(yán)重威脅到了人類的健康問(wèn)題，因此受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。在醫(yī)學(xué)上，牙菌斑中及人體內(nèi)植入器械上的生物被膜因其對(duì)人類健康的危害而得到了廣泛的研究。而在食品工業(yè)中，生物被膜除了能夠腐蝕管道和金屬表面外，更可導(dǎo)致動(dòng)植物及人類疾病發(fā)生［1］。本綜述在介紹什么是生物被膜的基礎(chǔ)上闡述了其對(duì)人類的具體危害，并對(duì)當(dāng)前生物被膜的控制方法和檢測(cè)方法做了概述。

1　生物被膜的定義和特點(diǎn)

生物被膜（biofilm，BF）是指粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS），將自身包繞其中而形成的微生物群落［1］，它是細(xì)菌等微生物在自然界中存在的主要形式。20世紀(jì)30年代中期，COSTERTON JW等［2］對(duì)口腔中牙菌斑生物被膜細(xì)菌和齲齒的關(guān)系做了大量的研究，為深入了解生物被膜在健康和疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)生物被膜相關(guān)的研究在國(guó)內(nèi)逐漸受到重視，但國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)它的命名并不統(tǒng)一，唐俊妮等［3-4］將其翻譯為“生物膜”和“生物菌膜”，韓北忠等［5-6］將其翻譯為生物被膜。生物學(xué)上的生物膜（biomembrane）是指鑲嵌有蛋白質(zhì)和糖類的磷脂雙分子層，起著劃分和分隔細(xì)胞和細(xì)胞器作用，也是與許多能量轉(zhuǎn)化和細(xì)胞內(nèi)通訊有關(guān)的重要部位，是細(xì)胞、細(xì)胞器和其環(huán)境接界的所有膜結(jié)構(gòu)的總稱。顯然，將biofilm翻譯為生物被膜更為合適。

隨著近年來(lái)對(duì)生物被膜研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)自然界中的生物被膜毫無(wú)例外地是由混合微生物形成的。生物被膜中的成分十分復(fù)雜，含有細(xì)菌、細(xì)菌分泌的大分子多聚物（如蛋白質(zhì)、多糖、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、肽聚糖、磷脂等）、吸附的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物及細(xì)菌裂解產(chǎn)物等［7-8］。DAVIESD G等［9］在應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)研究生物被膜結(jié)構(gòu)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)生物被膜呈獨(dú)特的三維立體結(jié)構(gòu)，而細(xì)菌在生物被膜總體積中只占不到1/3，其余大部分都是由細(xì)菌分泌的胞外多糖和其他粘性物質(zhì)等。生物被膜的分布十分廣泛，在適宜細(xì)菌生長(zhǎng)的各種物體表面均可發(fā)現(xiàn)，同時(shí)，生物被膜加強(qiáng)了微生物對(duì)于不利環(huán)境的抗性，使其難以被酸、堿、強(qiáng)氧化劑及抗生素等清除［10］。因此，對(duì)生物被膜的形成機(jī)理及去除機(jī)制的研究尤其重要。

2　生物被膜的形成過(guò)程

近年來(lái)，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者致力于研究生物被膜形成的機(jī)制，讓我們對(duì)于生物被膜的認(rèn)知也不斷加深?，F(xiàn)在，學(xué)界普遍認(rèn)為生物被膜的形成經(jīng)歷了三個(gè)階段：粘附期、發(fā)展期和成熟期。這三個(gè)階段中生物被膜經(jīng)歷了從浮游態(tài)到粘附結(jié)構(gòu)態(tài)，從低密度到高密度的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程是由多種基因共同調(diào)控的結(jié)果［11］。微生物細(xì)胞從浮游態(tài)到成熟的生物被膜態(tài)的發(fā)展過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1　微生物細(xì)胞從浮游態(tài)到成熟的生物被膜態(tài)的發(fā)展模擬圖［15］Fig．1 Models of the development of a m ature biofilm from planktonic cells［15］

2.1附期

浮游態(tài)的細(xì)菌粘附到含有蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的材料表面。此過(guò)程中細(xì)菌表面特定的粘附蛋白特異性地識(shí)別生物材料表面的受體，產(chǎn)生的附著力讓細(xì)菌在接觸表面固定［12-14］。根據(jù)細(xì)菌粘附在材料表面的原理不同，此粘附過(guò)程可分為可逆粘附和不可逆粘附。浮游細(xì)菌首先在流體或是自身鞭毛的作用下接觸到材料表面，同時(shí)其他附著結(jié)構(gòu)識(shí)別該材料使其固定于材料表面，此時(shí)的粘附為可逆粘附。隨后微生物通過(guò)分泌的胞外多聚物使其牢固地附著于材料表面，此時(shí)的粘附為不可逆粘附。當(dāng)生物被膜處于粘附期時(shí)，它的狀態(tài)相對(duì)不穩(wěn)定，可以通過(guò)沖洗、加熱等物理方法清除生物被膜。

2.2展期

細(xì)菌大量分泌胞外多聚物粘附單個(gè)細(xì)胞是生物被膜不斷壯大。此過(guò)程中細(xì)菌開(kāi)始大量繁殖，同時(shí)調(diào)整基因表達(dá)產(chǎn)生大量的胞外物質(zhì)，讓分裂產(chǎn)生的細(xì)菌及接觸到的環(huán)境中的其他細(xì)菌一并粘附在此生物被膜中，讓生物被膜不斷加厚成熟，增強(qiáng)其對(duì)于不利環(huán)境的抗性［15］。

2.3熟期

生物被膜中的部分細(xì)菌溶解脫落下來(lái)，重新轉(zhuǎn)移粘附到材料表面形成新的生物被膜。此過(guò)程中，細(xì)菌產(chǎn)生了大量的胞外多聚物，形成穩(wěn)定的致密的成熟的生物被膜。此階段，生物被膜內(nèi)部的結(jié)構(gòu)組成不是均勻的，而是在該結(jié)構(gòu)中新老交替的菌落共植體。生物被膜中的細(xì)菌在時(shí)間上和空間上的多樣性，是其均有強(qiáng)大的抗逆性的基礎(chǔ)之一。同時(shí)生物被膜中的微生物菌落間可以進(jìn)行水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物等的運(yùn)輸［16］。此時(shí)的生物被膜已經(jīng)發(fā)育成熟，生物被膜中的部分細(xì)菌在其內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制或在外部沖刷等作用下可以從生物被膜結(jié)構(gòu)中脫落出來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下重新轉(zhuǎn)移粘附到材料表面產(chǎn)生新的生物被膜結(jié)構(gòu)。成熟期的生物被膜已經(jīng)十分穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境中不利因素的耐受能力也達(dá)到最強(qiáng)。

3　細(xì)菌生物被膜形成及主要調(diào)控機(jī)制

細(xì)菌開(kāi)始形成生物被膜的重要原因之一是以其菌毛通過(guò)非特異性的電引力或疏水作用與材料表面相結(jié)合［17］。這個(gè)過(guò)程使細(xì)菌黏附在宿主表面是其形成生物被膜的第一步，主要是通過(guò)細(xì)菌表面特定的粘附素蛋白識(shí)別宿主表面受體而形成黏附，因此具有選擇性和特異性［18］。

在細(xì)菌生物被膜的形成過(guò)程中，細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing system，QS）發(fā)揮著重要的作用。隨著細(xì)菌的代謝和繁殖，細(xì)菌在代謝過(guò)程中釋放自誘導(dǎo)物到周圍環(huán)境中，菌體密度增加，菌體產(chǎn)生的自誘導(dǎo)物的濃度也在增加。當(dāng)周圍環(huán)境中自誘導(dǎo)物濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，就會(huì)激活細(xì)菌表面或內(nèi)部的受體，轉(zhuǎn)化為細(xì)菌胞內(nèi)代謝的生化信號(hào)，從而誘導(dǎo)細(xì)菌特定基因表達(dá)，使細(xì)菌產(chǎn)生適應(yīng)性的生理變化，這種適應(yīng)性變化行為包括進(jìn)行DNA復(fù)制、細(xì)胞繁殖、形成生物被膜、產(chǎn)生致病因子以及形成孢子等，這種調(diào)控行為被稱為群體感應(yīng)［19］。

與細(xì)菌生物被膜形成有關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要有3類：酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acyl-homoserine lactone，AHL）密度感應(yīng)系統(tǒng)又稱Ⅰ型自誘導(dǎo)物（autoinducter-1，AI-2）密度感應(yīng)系統(tǒng)、小分子多肽自誘導(dǎo)物（autoinducter peptide，AIP）密度感應(yīng)系統(tǒng)以及Ⅱ型自誘導(dǎo)物（autoinducter-2，AI-2）密度感應(yīng)系統(tǒng)［19］。在不同的密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用下，不同細(xì)菌分泌的自誘導(dǎo)物也不同。革蘭氏陰性細(xì)菌一般利用?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）類分子作為信號(hào)因子；革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌—般利用寡肽類分子（AIP）作為群體感應(yīng)調(diào)控過(guò)程中的信號(hào)因子。另外，許多革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌都可以產(chǎn)生一種AI-2的信號(hào)因子，一般認(rèn)為AI-2是一種不同種間細(xì)胞交流的通用信號(hào)分子。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在生物被膜的形成過(guò)程中有些細(xì)菌可以同時(shí)利用兩種甚至3種不同信號(hào)分子調(diào)節(jié)自身群體行為［20］，這說(shuō)明細(xì)菌的群體感應(yīng)機(jī)制是極為復(fù)雜的。

4　生物被膜在食品加工過(guò)程中的危害

在食品工業(yè)中生物被膜的研究主要集中在肉制品、乳及乳制品等領(lǐng)域。研究表明，幾乎所有的細(xì)菌在一定條件下都可以形成生物被膜。而引起食品污染機(jī)會(huì)較多的沙門氏菌屬（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）、李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）等常見(jiàn)的食源性致病菌，在環(huán)境中普遍存在，他們?cè)谝欢ǖ臈l件下也能形成不易去除的生物被膜［21］。細(xì)菌黏附在食品、各種食品加工接觸面及非食品加工接觸面（如墻壁、下水道、死角等地方）后形成生物被膜，再經(jīng)手或空氣等途徑污染食品從而引起食物中毒［21-22］。由于其難以去除的特性，即使在食品加工中經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的清洗消毒工序，微生物生物被膜還有可能逗留在食品接觸表面并危害食品安全。因此，控制食品中各種致病菌及條件致病菌的污染，特別是防止其形成生物被膜交叉污染食品，是控制食源性疾病發(fā)生的重要內(nèi)容之一。

5　生物被膜的控制方法

根據(jù)生物被膜形成的過(guò)程，常見(jiàn)的控制生物被膜的方法主要有三類，分別是阻止微生物粘附、抑制生物被膜的形成以及清除已經(jīng)形成生物被膜。常見(jiàn)的手段包括物理方法（刮、擦、高壓水流沖洗等）、化學(xué)方法（抗生素、殺菌劑和天然抑菌成分等）和生物學(xué)方法（分子生物學(xué)手段等）。

去除生物被膜常見(jiàn)的物理方法有超高磁場(chǎng)、超聲波處理、高脈沖電場(chǎng)、低電場(chǎng)等［5］，這些方法都是通過(guò)不同的物理原理，達(dá)到去除生物被膜的目的。楊葆華等［23］用優(yōu)化的超聲波法，利用超聲波的“空化”效應(yīng)，設(shè)定超聲波功率135W，處理時(shí)間14min，處理溫度35℃，可將生物被膜從接觸表面有效得充分剝離，實(shí)驗(yàn)效果優(yōu)于平板擦拭法。DEL POZO JL等［24］證明了應(yīng)用低強(qiáng)度的電流能夠增強(qiáng)抗菌劑對(duì)生物被膜的抗菌活性。VLEUGELSM等［8］研究發(fā)現(xiàn)，常壓等離子體技術(shù)對(duì)細(xì)菌形成的生物被膜具有殺菌作用，該技術(shù)是利用高壓放電在低氣壓狀態(tài)下發(fā)生輝光放電產(chǎn)生活性氧和自由基來(lái)滅活微生物，對(duì)生物被膜中的微生物同樣有殺滅作用。NIEM IRA B A等［25］認(rèn)為電離輻射是一種有效的去除生物被膜的物理方法，對(duì)食品接觸的衛(wèi)生設(shè)備表面生物被膜及其相關(guān)的細(xì)菌有良好的去除及殺滅作用。

陳秋云等［26］研究了常用殺菌劑對(duì)生物被膜的作用，發(fā)現(xiàn)生物被膜形成過(guò)程中細(xì)胞代謝產(chǎn)生的一些有機(jī)物質(zhì)對(duì)殺菌劑的殺菌效果影響較大，這可能是導(dǎo)致生物被膜態(tài)細(xì)菌比浮游態(tài)細(xì)菌對(duì)殺菌劑的抗性大的原因。CHAW K C等［27］研究發(fā)現(xiàn)，離子狀態(tài)的銀離子可以與生物分子的供電子基團(tuán)表面結(jié)合，從而通過(guò)減小生物被膜基質(zhì)與胞外多聚物的分子間作用力來(lái)減少生物被膜的黏附作用。SCHLAG S等［28］證實(shí)了5mmol/L的亞硝酸鹽能有效地抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。孫紀(jì)錄等［29］證實(shí)了電解水對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜有良好的去除作用。另外，一些天然提取物作為新的殺菌劑也具有抑制生物被膜形成的能力，以及醫(yī)學(xué)上使用的一些抗生素（如阿奇霉素、萬(wàn)古霉素等），都已被證明對(duì)金黃色葡萄球菌（S.aureus）生物被膜及被膜中的菌有殺滅作用［30-31］。

6　生物被膜的檢測(cè)方法

由于生物被膜的特點(diǎn)，決定了其檢測(cè)方法應(yīng)快速、靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，這樣才能更有效地控制由生物被膜引起的食品污染，防止食源性疾病的發(fā)生。目前檢測(cè)細(xì)菌生物被膜的方法主要有平板法、銀染法、玻璃管法、結(jié)晶紫染色法、生物發(fā)光法和熒光顯微鏡法等［32］。近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，一些新的檢測(cè)方法也逐步發(fā)展起來(lái)，如PCR鑒定、肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探針熒光原位雜交技術(shù)等［33］。由于分子生物學(xué)方法在生物被膜形成機(jī)制方面研究上的應(yīng)用，有研究表明生物被膜的形成與某些特定的基因相關(guān)，通過(guò)PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地診斷出是否存在決定生物被膜形成的基因［34］。這些方法中最常用的還是傳統(tǒng)的染色法和顯微鏡法。隨著顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，掃描電鏡（scanning electronmicroscope，SEM），激光共聚焦顯微鏡（scanning laser confocalmicroscope，CLSM）等較為先進(jìn)的顯微技術(shù)可以直接檢測(cè)生物被膜表層的形態(tài)學(xué)，對(duì)于細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)可清楚地辨別，其中CLSM還可用于生物被膜立體結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)研究。

隨著研究的不斷深入和飛速發(fā)展，用于生物被膜形成能力的檢測(cè)方法的種類也越來(lái)越多，但這些檢測(cè)方法仍有許多缺陷。因此，在實(shí)際的研究過(guò)程中，一般都會(huì)結(jié)合幾種方法對(duì)生物被膜進(jìn)行檢測(cè)，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

7　結(jié)語(yǔ)

與浮游態(tài)細(xì)菌相比，生物被膜有著更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、更廣泛的信息溝通和更精密的調(diào)控機(jī)制，這就導(dǎo)致了其在人們的日常生活中更難以對(duì)付。目前關(guān)于細(xì)菌生物被膜的研究主要集中在污水處理、醫(yī)藥領(lǐng)域、生物工程材料、食品加工與安全等學(xué)科［32］。今后的研究方向應(yīng)集中在生物膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制與生物被膜的控制技術(shù)等領(lǐng)域。利用基因芯片、基因敲除等分子技術(shù)，結(jié)合核磁共振等代謝組學(xué)分析技術(shù)，以及原子力術(shù)、激光共聚焦等先進(jìn)的顯微鏡呈像技術(shù)等，從基因組水平、代謝組學(xué)水平及實(shí)際空間結(jié)構(gòu)等分析，構(gòu)建生物被膜模型。通過(guò)這幾個(gè)方向的綜合研究，可以明確不同時(shí)期生物膜形成的結(jié)構(gòu)及其形成的代謝機(jī)理，為建立有效的生物膜去除和預(yù)防策略將奠定理論基礎(chǔ)。

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Hazard and control of bacterial biofilm during the food processing

CHEN X iaoxue，CHEN Jingyu，HAN Beizhong*
（Beijing Laboratory forFood Quality and Safety，College ofFood Science&Nutritional Engineering，China AgriculturalUniversity，Beijing 100083，China）

The microorganisms in biofilms live in amatrix of extracellular polymeric substances（EPS）that form their immediate environment. Biofilm formation represents a protected mode of growth that allows cells to survive in hostile environments and also disperses to colonize new niches，causingmore serious biological hazards to food industry.Biofilm would increase survival rate ofm icroorganism，therefore，it is difficult to clean and sterilize，causing food contam ination.This paper introduced the characters and the formation process of biofilms and discussed the formationmechanism of biofilms，summarized the hazard and control and detectionmethodsof biofilm，in order to improve people'sunderstanding ofbiofilm and promote the research developmentin the field.

R155．5

0254-5071（2016）01-0001-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．001

2015-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（31371716）

陳小雪（1988-），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。

韓北忠（1961-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)與發(fā)酵工程。