唐　真，王　駿，陳桂光，梁智群，韋宇拓，曾　偉（1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 50004；2.廣西大學(xué) 微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西 南寧 50004；.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 50004）

γ-聚谷氨酸高黏發(fā)酵液中細菌總核糖核酸提取方法的比較

唐真1，2，3，王駿1，2，3，陳桂光3，梁智群1，2，3，韋宇拓1，2，3，曾偉1，2，3*
（1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué) 微生物及植物遺傳工程教育部重點實驗室，廣西 南寧 530004；3.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004）

高黏度發(fā)酵液具有菌體不易分離的特點。為了從γ-聚谷氨酸高黏發(fā)酵液中提取細菌總核糖核酸，利用磷酸緩沖液稀釋發(fā)酵液、離心收集、焦碳酸二乙酯水洗滌以及溶菌酶處理的四步法收集菌體并制備核糖核酸待分離樣品，進而分別采用RNAiso plus提取法，EZ-10 RNAM iniprep kit試劑盒及PureLink RNAM inikit試劑盒法提取總核糖核酸，并通過瓊脂糖凝膠電泳、核酸濃度檢測儀和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)比較了三種方法提取總核糖核酸的效果。結(jié)果表明，四步法獲得的菌體樣品可以滿足后續(xù)總核糖核酸提取的要求，三種方法提取的核糖核酸均能滿足一般反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)的要求，其中PureLink和RNAiso提取的核糖核酸A260nm/A230nm＞2.0，純度較好，PureLink具有快速提取的優(yōu)勢而RNAiso則適用于大量樣品的提取。

高黏度發(fā)酵液；枯草芽孢桿菌；菌體分離；總核糖核酸提取；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutam ic acid，PGA）是一種由L-谷氨酸和D-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基聚合而成的生物高分子化合物，因其具有良好的生物兼容性、保水性、可降解和可塑性，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品以及肥料添加劑等領(lǐng)域［1］。過去的研究主要集中在優(yōu)良菌種選育［2］、發(fā)酵工藝開發(fā)和產(chǎn)物分離純化等方面［3］，但隨著相關(guān)研究的不斷深入，人們對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PGA的合成代謝機制等理論研究越來越感興趣［4］。但是，PGA分子質(zhì)量可達1.0×106u以上，其發(fā)酵液黏稠，造成菌體收集十分困難。因此，如何從這類高黏發(fā)酵物系中快速收集菌體用于獲取高質(zhì)量的核酸或蛋白質(zhì)樣品，對于相關(guān)理論研究顯得尤為重要。

高質(zhì)量的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）是進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、Northern雜交、RNA-seq、cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)實驗的前提［5］。目前，對總RNA提取的研究主要集中在真核生物上，如血液等高等生物的組織［6］，富含多酚多糖的植物材料［7-8］，也有針對特殊條件下細菌總RNA提取的研究（如活性污泥［9］、泥沙［10］、Bacillus subtilis 168休眠和發(fā)芽的孢子等［11］），且建立了很多成熟的操作方法。然而，針對PGA等高黏性發(fā)酵液中細菌總RNA提取的研究少有報道。

目前，雖然自動化核酸和蛋白質(zhì)提取系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床和大規(guī)模測序方面［12］，但是在普通實驗室使用較多的仍是商業(yè)化試劑盒及傳統(tǒng)的試劑提取方法。本研究利用四步法快速收集PGA高黏發(fā)酵液中的菌體并制備總RNA待分離樣品，在此基礎(chǔ)上采用RNAiso plus提取法、EZ-10 RNA M iniprep kit試劑盒及PureLink RNA M inikit試劑盒法對高黏發(fā)酵液細菌總RNA的提取進行了比較，分析討論了各種方法的優(yōu)缺點，希望給類似研究條件下的研究者提供參考。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1種

Bacillus subtilis GXA-28：本實驗室自主選育獲得，保藏編號CCTCCM 2012347，用于制備PGA高黏度發(fā)酵液［13］。

1.1.2養(yǎng)基［14］

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，谷氨酸鈉5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.5。

斜面培養(yǎng)基：組分同種子培養(yǎng)基，加瓊脂粉15 g/L，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏2.5 g/L，谷氨酸鈉20 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 6.5。

1.1.3要試劑

焦碳酸二乙酯水（diethy pyrocarbonate，DEPC）：用去離子水配制成體積分數(shù)0.1%，用磁力攪拌器攪拌過夜，高溫高壓處理。

磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH 6.5）：取68.5m L 0.2mol/L NaH2PO4·2H2O，31.5m L 0.2mol/LNa2HPO4·2H2O，混勻。

TBE緩沖液（5×）：Tris5.4 g，硼酸2.72 g，乙二胺四乙酸二鈉0.37 g，定容至100m L。

RNAisoplus：日本Taraka公司；EZ-10RNAM iniprep kit：生工生物工程（上海）股份有限公司；PureLink RNA M ini kit、DNaseI、RevertAid First Stand cDNA Synthnesis kit：賽默飛世爾科技公司；QuantiTaqTMThermostable DNA Polymerase：美國GeneCopoeia公司；氯仿、異丙醇（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；無水乙醇（分析純）：成都科龍化工試劑廠。

所有溶液均用DEPC水配制；所用玻璃、金屬制品等用0.1%DEPC水處理，121℃高溫處理30min后烘干備用。所用塑料制品均為RNase-free。

1.2器與設(shè)備

SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療儀器廠；SKY-211C型搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；J2-21高速冷凍離心機：美國Beckman公司；5424R臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；T1 Thermocycler PCR儀：德國Biometra公司；M ini-sub水平電泳系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3驗方法

1.3.1體培養(yǎng)

取1環(huán)斜面菌種接于種子培養(yǎng)基中，42℃條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后作為種子液。按2%接種量吸取種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，42℃條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng)22 h后作為發(fā)酵液用于后續(xù)實驗。

1.3.2體收集及處理

利用磷酸緩沖液稀釋發(fā)酵液、離心收集菌體、DEPC水清洗菌體以及溶菌酶處理菌體的四步法獲得RNA待分離樣品。具體操作如下：取發(fā)酵液5m L，用0.2mol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）按體積比稀釋4倍，輕輕振蕩混勻，4℃、12 000×g離心5min，棄去上清，得到菌體沉淀。取適量0.1%DEPC水洗滌菌體，用移液槍充分吹散菌體后，4℃、8 000×g離心1m in，收集菌體；重復(fù)洗滌1次。在提取RNA之前，向上述菌體加入100μL溶菌酶（3mg/m L），用移液槍輕輕吹散菌體后，置于37℃恒溫水浴鍋中處理15min。

1.3.3RNA提取

（1）RNAiso plus法：在溶菌酶處理后的菌液中加入適量RNAiso plus，混勻，室溫靜置5m in；4℃、12 000×g離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5m L EP管中；加入1/5體積的氯仿劇烈振蕩15 s，待液體呈乳濁狀時，靜置5m in；4℃、12 000×g離心15min，此時樣品分成三層，轉(zhuǎn)移水相于新的1.5m L EP管中，加入2倍體積異丙醇，混勻，室溫靜置10min；4℃、12 000×g離心10min，移去上清保留沉淀物，用適量體積分數(shù)75%的乙醇清洗沉淀；4℃、8 000×g離心5m in，棄去上清保留沉淀物，室溫條件下干燥5～10min；-80 ℃保存。

（2）EZ-10RNAM iniprep kit試劑盒法：參照上海生工EZ-10 RNA M iniprep kit說明書進行操作，在溶菌酶處理后的菌液中加入350μL裂解液，混勻，室溫靜置5m in；轉(zhuǎn)移至收集柱中，室溫靜置1min，9 000×g離心1min，將流出液轉(zhuǎn)移至新的1.5m LEP管中，加入250μL無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移至RZ-10柱子，9 000×g離心1min，棄去流出液，加入500μLGT液，室溫靜置1min，9 000×g離心1min，棄去流出液，再加入500μL NT液，室溫靜置1min，9 000×g離心1min棄去流出液后，9 000×g再次離心2min，將RZ-10柱子置于新的1.5m LEP管中，開蓋放置3～5m in后加入30μL RNA-free水，室溫放置2min，9 000×g離心2min，獲得的RNA于-80℃保存。

（3）PureLink RNA M ini kit試劑盒法：參照Thermo Fisher Scientific PureLink RNA M inikit說明書進行操作，在溶菌酶處理后的菌液中加入適量350μL裂解液，混勻后加入250μL無水乙醇，混勻后將液體轉(zhuǎn)移至spin柱子中，12 000×g室溫離心2m in，棄去收集管中的液體，重新將spin管置于收集管中，加入700μL洗脫液Ⅰ，12 000×g室溫離心30 s，棄去收集管中的液體，并將spin柱子置入新的收集管中，加入500μL洗脫液Ⅱ，12 000×g室溫離心30s，棄去收集管中的液體，重新加入500μL洗脫液Ⅱ，再次洗脫，棄去收集管的液體，12 000×g室溫離心1m in，棄去收集管，將spin柱子置于新的1.5 m L EP管中，加入30μL RNA-free水，室溫靜置1min，12 000×g室溫離心2min，獲得的RNA保存于-80℃。

1.3.4RNA質(zhì)量檢測

取RNA樣品5μL，在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測RNA純度及完整性；取RNA樣品2μL，在Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測定儀上測定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm，檢測RNA質(zhì)量濃度（ng/μL）及純度。

1.3.5RT-PCR分析

將上述三種方法所提總RNA用DnaseI處理，RevertAid FirstStand cDNA SynthnesisKit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 1μg，100μmol/L隨機引物1μL，5×反應(yīng)Buffer 4μL，10mmol/L dNTP混合物2μL，200 U/μL反轉(zhuǎn)錄酶1μL，不含核酸酶的水補充至總體積20μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：25℃放置5m in；60℃保溫60m in；72℃加熱5min。cDNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以上述所得cDNA為模板進行RT-PCR，擴增目的基因rpoA（RNA聚合酶亞基），上游引物5′-TTCGTAGAGCCACTTGAGCGT-3′，下游引物5′-TGTTGTTACAGCGGCACCAG-3′，引物合成委托上海生工完成。反應(yīng)體系：cDNA模板1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，上下游引物各1μL，Taq酶0.4μL，ddH2O 18.6μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2m in，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸6 s，循環(huán)35次；72℃延伸7min。取PCR產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2　結(jié)果與分析

2.1體收集

PGA發(fā)酵液黏度隨著PGA質(zhì)量濃度和分子質(zhì)量的增加而增大，當PGA質(zhì)量濃度＞10 g/L、PGA分子質(zhì)量＞1.0×106u時，利用常規(guī)高速離心方法很難收集到菌體細胞。在PGA工業(yè)生產(chǎn)過程中，常常采用酸化和自來水稀釋的方法，將發(fā)酵液黏度降低后去除菌體，從而對PGA進行提取純化。然而，酸化稀釋處理后，菌體細胞受損嚴重，胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)遭到破壞。因此，如何快速大量收集完整的菌體細胞是開展胞內(nèi)核酸或蛋白質(zhì)提取實驗的前提。

取PGA發(fā)酵液（質(zhì)量濃度18 g/L；PGA分子質(zhì)量＞2.0×106u）50m L分別采用直接離心、蒸餾水稀釋4倍體積后離心、0.2mol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）稀釋4倍體積后離心收集菌體；對照組采用蒸餾水稀釋發(fā)酵液4倍體積后、再用6mol/LHCl酸化稀釋液至pH 3.0，然后離心收集菌體。對離心時間和菌體收集量進行比較，離心均在4℃、12 000×g條件下進行。將對照組收集到的菌體干質(zhì)量定義為100%。結(jié)果（表1）顯示，磷酸緩沖液稀釋后離心10min可收集到91.2%的菌體細胞，隨著離心時間的增加，菌體收集量沒有明顯增加；而直接離心20 min，收集的菌體細胞只有42.1%；蒸餾水稀釋后離心20min，收集的菌體細胞也只有78.2%。因此，無論是從離心時間還是菌體收集量來看，采用0.2mol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）稀釋4倍體積后離心收集菌體的方法最為合適。

表1　不同菌體收集方法比較Table 1 Comparison of differentbacterial collectionmethod

2.2脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量

細胞RNA主要包括rRNA、tRNA、mRNA 3種形式，其中rRNA約占80%，tRNA約占10%～15%，mRNA約占1%～5%，而rRNA又分為23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA三種類型［15］。獲取高質(zhì)量的總RNA樣品是開展RT-PCR、Northern雜交、RNA-seq、cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)實驗的前提。

利用磷酸緩沖液稀釋離心收集到的菌體，經(jīng)DEPC水清洗菌體以及溶菌酶處理后，采用RNAiso plus提取法、EZ-10 RNA M iniprep kit試劑盒及PureLink RNA M inikit試劑盒提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，結(jié)果顯示，3種方法均能提取出一定量的總RNA，但提取質(zhì)量和純度存在差異（圖1）。RNAiso plus法提取的總RNA，23S、16S、5S三條帶清晰、完整；而EZ-10和PureLink試劑盒提取的總RNA，只有23S和16S兩條帶；說明RNAiso plus法對小分子量RNA有較好的提取效果。3種方法提取的總RNA均沒有向小分子質(zhì)量區(qū)域擴散的現(xiàn)象，說明所提總RNA基本沒有降解。但是，PureLink試劑盒提取的總RNA在＞2 000 bp處有明顯的條帶，說明有基因組DNA殘留；EZ-10試劑盒提取的總RNA有明顯的拖尾現(xiàn)象，點樣口也有亮帶，說明所提RNA中可能殘留蛋白等雜質(zhì)。此外，用RNAiso plus提取法和EZ-10試劑盒提取的總RNA，在23S上方存在一條＜2 000 bp亮帶，該現(xiàn)象比較特殊，推測有可能是小分子DNA片段。

圖1 3種方法提取總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoretog ram of total RNA by three m ethods

2.3RNA濃度和純度檢測

總RNA濃度采用核酸蛋白濃度測定儀測定。通常評價RNA純度的標準：A260nm/A280nm為1.90～2.10；A260nm/A230nm為2.00～2.40。若A260nm/A280nm＜1.90，說明樣品中存在蛋白質(zhì)污染；若260nm/A230nm＜2.00，說明樣品中存在多聚糖、胍鹽和β-巰基乙醇等污染［16］。

表2 3種方法提取總RNA的濃度及純度比值Table 2 Concentration and purity of totalRNA by three differentmethods

3種方法所提總RNA經(jīng)核酸蛋白濃度測定，結(jié)果（表2）顯示，PureLink試劑盒和RNAiso法所提總RNA，其A260nm/A280nm均在2.0左右，說明蛋白殘留較少；而EZ-10試劑盒法所提總RNA樣品，其A260nm/A280nm低于1.90，說明有蛋白質(zhì)殘留，此結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致。3種方法所提總RNA，A260nm/A230nm也存在一定差異，其中PureLink試劑盒和EZ-10試劑盒法所提總RNA樣品，A260nm/A230nm＞2.0，說明純度較好，可能是由于兩者在提取過程中均采用過柱提純，小分子去除比較完全；而RNAiso法所提總RNA樣品，A260nm/A230nm＜2.0。從總RNA濃度來看，RNAiso法所提總RNA濃度最高，而PureLink試劑盒所提總RNA濃度最低。

2.4RT-PCR檢測

3種方法所提總RNA經(jīng)DNaseI消化后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增看家基因rpoA（RNA聚合酶亞基，96 bp），擴增結(jié)果如圖2所示，條帶清晰、大小正確。說明三種方法提取的RNA均能滿足基本的分子生物學(xué)實驗要求。

圖2 RT-PCR擴增rpoA基因電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of rpoA gene by RT-PCR am plification

3　結(jié)論

枯草芽孢桿菌是典型的原核生物，相比真核生物RNA含量少，半衰期短，同時枯草芽孢桿菌具有旺盛的分泌系統(tǒng)，分泌的蛋白質(zhì)、核酸酶等對RNA提取造成很大干擾。此外，對于合成高分子量代謝產(chǎn)物的微生物，其發(fā)酵液黏度大，常規(guī)的稀釋離心法很難收集到足夠量的菌體細胞。在本實驗中，利用DEPC水配制的磷酸緩沖液對發(fā)酵液進行稀釋，并快速離心收集菌體；同時采用DEPC水對菌體細胞進行洗滌，進一步去除了細胞外雜質(zhì)；在RNA提取前使用溶菌酶處理菌體，使細胞裂解更完全。通過上述四步操作，有效的提高了RNA提取質(zhì)量。

RNAiso plus提取法是經(jīng)典的手提方法，而EZ-10RNA M iniprep kit和PureLink RNAM inikit則是兩種商業(yè)化試劑盒。PureLink法和RNAiso法提取效果較好，但從A260nm/A230nm來看，RNAiso法存在小分子殘留。從濃度來看，RNAiso法提取的總RNA濃度最大。EZ-10則出現(xiàn)了向點樣孔方向拖尾的現(xiàn)象，說明存在蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)的污染?？傮w而言，對于RT-PCR實驗，三種方法均能達到要求。如果是對RNA純度要求高、RNA含量要求多的qRT-PCR實驗，則需考慮使用RNAiso法。從提取時間來看，PureLink法用時最短，其次是EZ-10，而RNAiso法提取所用時間最長。如果需進行Northern雜交等實驗，則可以選擇PureLink法。因此，實驗人員可以根據(jù)實驗材料及后續(xù)實驗要求選擇合適的方法。

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Comparison of bacterial total RNA extraction methods in the high viscosity fermentation broth of poly-γ-glutamic acid

TANG Zhen1，2，3，WANG Jun1，2，3，CHEN Guiguang3，LIANG Zhiqun1，2，3，WEIYutuo1，2，3，ZENGWei1，2，3*
（1.State Key Laboratory forConservation and Utilization ofSubtropical Agro-bioresources，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China；2.Key Laboratory ofM inistry ofEducation forM icrobialand PlantGenetic Engineering，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China；3.College ofLife Science and Technology，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China）

Thebacteria aredifficult to be separated in the high viscosity fermentation broth.In order to extractbacterial totalRNA from high viscosity fermentation broth of poly-γ-glutam ic acid，fourstepswere taken to obtain the bacteria and prepare sample containing RNA used for separation.The four steps included dilute fermentation broth by phosphate buffer solution，centrifugation，wash cellby DEPC water and lysozyme treatment.Then，total RNA were extracted by RNAiso plusmethod，EZ-10 RNA M iniprep kitmethod and PureLink RNA M inikitmethod.The RNA extraction effectsof agarose gel electrophoresis，nucleic acid concentration detector and reverse transcription PCR were compared.Results showed that the sample obtained by the four-stepmethod met the requirementsof total RNA extraction.Total RNA extracted by the threemethodsallmet the requirementsof the RT-PCR experiments.However，the A260nm/A230nmof RNA that extracted by RNAiso plusmethod and PureLink RNA Minikitmethod were larger than 2.0，and bothmethodsshoned good purity.The PureLink M ini itmethod had the advantagesof rapid extraction and the RNAiso was suitable for theextraction of large quantitiesof samples.

high viscosity fermentation broth；Bacillussubtilis；bacterial isolation；total RNA extraction；reverse transcription PCR

Q93-33

0254-5071（2016）01-0024-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．006

2015-11-13

國家自然科學(xué)基金資助項目（31560448）；廣西自然科學(xué)基金資助項目（2015GXNSFBA 139052）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目（YCSZ2015042）

唐真（1990-），女，碩士研究生，研究方向為工業(yè)微生物的代謝調(diào)控。

曾偉（1987-），男，助理研究員，博士，研究方向為工業(yè)微生物的發(fā)酵工藝、代謝調(diào)控及生物制品開發(fā)應(yīng)用。