賈青慧，盧紅梅，，陳　莉，張麗平（.貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550000；.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550000）

增效因子對木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素發(fā)酵液中物質(zhì)變化的影響

賈青慧1，盧紅梅1，2*，陳莉2，張麗平2
（1.貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550000；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550000）

在木醋桿菌（Acetobacterxylinum）產(chǎn)細菌纖維素（BC）培養(yǎng)基中，添加一定量的增效因子，考察增效因子椰子水、玉米漿、Tween-80、羧甲基纖維素（CMC）、煙酸和生物素對發(fā)酵液中細菌纖維素產(chǎn)量、總糖、總酸和有機酸含量的影響。結(jié)果表明，10%玉米漿及60%椰子水對細菌纖維素產(chǎn)量的增效作用最強，細菌纖維素產(chǎn)量分別為8.534 g/L、6.008 g/L，與空白組相比，分別增加了4.67、2.99倍；添加60%椰子水，可以促進總糖含量降低，有利于木醋桿菌合成BC。添加各增效因子后發(fā)酵液內(nèi)總酸含量變化基本一致，整體均呈下降的趨勢。10%玉米漿試驗組有機酸含量最高，且其中葡萄糖酸、乳酸、乙酸和丁二酸等主體酸所占比例大，這與10%玉米漿對BC產(chǎn)量較為明顯的增效作用有一定關(guān)系。

細菌纖維素；總糖；總酸；有機酸；增效因子

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在化學結(jié)構(gòu)和化學組成上與植物纖維相同，但與植物纖維的區(qū)別在于細菌纖維素存在形式單一、純度高、不摻雜木質(zhì)素或半纖維等其余多糖。BC以單一纖維形式存在且分子取向一致，使其抗張強度、楊氏模量、硬度等高于植物纖維，同時細菌纖維素的超細三維納米纖維結(jié)構(gòu)（直徑在0.01～0.10μm）使其在伸長率、吸濕性、潤脹度、柔軟性和化學反應活性等方面優(yōu)于植物纖維。BC還具有成膜性能好、膜抗撕能力強、保水量高、透氣、透水性能好及濕強度高等特點［1］，BC的諸多特異性使其可用在很多領(lǐng)域（如作為健康的纖維食品，降低膽固醇［2］；作為優(yōu)良的人工骨修復材料［3］；用于生產(chǎn)薄形印刷紙，提高印刷性能［4］；利用其超精細結(jié)構(gòu)原位制備有機-無機雜化材料［5］；還可作為酶固定化載體［6］；且細菌纖維素膜在質(zhì)子交換膜燃料電池領(lǐng)域）具有美很好的應用前景［7］。目前，國內(nèi)外對于提高BC產(chǎn)量的研究，主要集中在培育高產(chǎn)菌株、優(yōu)化工藝條件、改進發(fā)酵方式和探討代謝機理等方面［8］，對于發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化較少研究，但添加增效因子后，各培養(yǎng)基內(nèi)生長因子種類、含量存在差異，可能會影響木醋桿菌的代謝，原有物質(zhì)的消耗和新物質(zhì)的生成也會不同，而這些不同與BC生成息息相關(guān)。

目前，在我國BC主要通過自然發(fā)酵椰子水生產(chǎn)，但由于原料具有季節(jié)性且自然發(fā)酵椰子水成分較為復雜［9］，嚴重限制了BC的商業(yè)化生產(chǎn)。在木醋桿菌產(chǎn)BC的試驗中發(fā)現(xiàn)，椰子水、玉米漿、Tween-80、羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose CMC）、煙酸和生物素等物質(zhì)的添加可增加BC產(chǎn)量，本研究通過在木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素發(fā)酵液中加入增效因子，對發(fā)酵液內(nèi)細菌纖維素、總糖、總酸、有機酸的含量進行跟蹤檢測，考察增效因子對發(fā)酵液中物質(zhì)含量變化的影響，以期為進一步研究木醋桿菌合成BC的機理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1種

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）：貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室保藏。

1.1.2料

椰子水為市售椰子破殼取水于冰箱中保藏；玉米漿為市售。

1.1.3劑

氫氧化鈉：重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；鹽酸：重慶川江化學試劑廠；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；海藻酸鈉、羧甲基纖維素（CMC）、亞硫酸鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；咖啡因、葡萄糖酸：阿拉丁試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市登科化學試劑有限公司；苯酚：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、酒石酸鉀鈉：成都金山化學試劑有限公司；酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、丙酮酸（色譜純）：美國Sigma公司。

1.1.4養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸1g/L，磷酸氫二鈉2 g/L，瓊脂20 g/L，用蒸餾水配制，121℃滅菌20min。

（2）木醋桿菌液體種子培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂1 g/L，無水乙醇3%，用蒸餾水配制，121℃滅菌20min。

（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨8.0 g/L，磷酸二氫鉀4.3 g/L，硫酸鎂2.5 g/L，用蒸餾水配制，121℃滅菌20min。

（4）添加物培養(yǎng)基：最適添加量分別為60%椰子水、10%玉米漿、Tween-80 0.8 g/L、CMC 4 g/L、煙酸1.0mg/L、生物素25mg/L，根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方稱取所需量的各種物質(zhì)，用蒸餾水配制，121℃滅菌20min。

1.2器與設(shè)備

SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；101-1型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；FA2004N型精密電子天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3驗方法

1.3.1養(yǎng)方法

（1）菌種活化：挑取適量原代木醋桿菌轉(zhuǎn)接至木醋桿菌斜面培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)72 h。

（2）液體種子培養(yǎng)：準確量取50m L液體種子培養(yǎng)基于250m L三角瓶中，121℃滅菌20min，冷卻后無菌地加入1.5m L無水乙醇，再接入活化的木醋桿菌3環(huán)，置于28℃、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

（3）靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：準確量取50m L發(fā)酵培養(yǎng)基于250m L三角瓶中，121℃滅菌20min，冷卻后接入木醋桿菌種子液8%，30℃靜置培養(yǎng)8 d。

1.3.2析方法

（1）細菌纖維素產(chǎn)量的測定：將細菌纖維素處理干凈，烘干后稱其干質(zhì)量，BC產(chǎn)量計算公式如下：

（2）總糖含量的測定：采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定。

葡萄糖標準曲線的繪制：吸取0、0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0m L、1.2m L、1.4m L、1.6m L葡萄糖標準溶液分別置于25m L比色管中，各加入3，5-二硝基水楊酸溶液2m L，置于沸水浴中煮2min，進行顯色，然后以流水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25m L，搖勻，以試劑空白調(diào)零，在波長540 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。

樣品處理：將發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心20min，取上清液5m L于250m L容量瓶中，加入30m L蒸餾水，5m L 6mol/L HCl，70℃水浴15min，冷卻至室溫，調(diào)pH值至7～8，并定容至250m L，作為試樣水解液備用。

樣品測定：吸取水解液1.0m L，置于25m L比色管中，各加入3，5-二硝基水楊酸溶液2m L，置于沸水浴中煮2min，進行顯色，然后以流水迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25m L，搖勻，以試劑空白調(diào)零，在波長540 nm處測定吸光度值。以葡萄糖標準曲線回歸方程求出樣品中總糖含量，總糖含量計算公式如下：

（3）總酸含量的測定

②He was kind of strange, but I liked him.他有點怪怪的，但我還是喜歡他。

采用國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的pH電位滴定法測定樣品中的總酸含量。

（4）有機酸含量的測定

有機酸含量的測定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定。

樣液制備：發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/m in離心20min，吸取上清液1.00m L，用超純水稀釋至10m L，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，濾液供分析用。

色譜條件：SB-AQ色譜柱（4.6mm×250mm，0.5μm），流動相：97%pH值為2.0的0.02mol/L KH2PO4和3%甲醇，紫外檢測波長210 nm，流速0.8m L/min，進樣量10μL，柱溫30℃，二極管陣列檢測器（diodearray detector，DAD）。

有機酸標準溶液配制及標準曲線繪制：準確稱取色譜純、葡萄糖酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸各0.25 g，分別放入25m L容量瓶中，配制成10m g/m L的單標儲備液。分別吸取各單標儲備液1.00 m L放入10m L容量瓶中，超純水定容，配成1.00mg/m L的混合標準品。取1.00mg/m L的混合標準品2.00m L、1.00m L、0.50m L、0.20m L、0.10m L分別放入10m L容量瓶中，超純水定容，配制成不同質(zhì)量濃度梯度的混標備用。進樣前過0.22μm的濾膜。在最佳色譜條件下每個質(zhì)量濃度進樣3次，繪制各有機酸標準曲線。以各有機酸標準曲線回歸方程計算樣品中有機酸含量。有機酸含量的計算公式如下：

有機酸含量（g/L）=C×K

式中：C為由線性回歸方程求得的樣液中某有機酸的質(zhì)量濃度，mg/m L；K為用于分析的樣液的稀釋倍數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1萄糖標準曲線的建立

以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig．1 Standa rd curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線線性回歸方程為y=0.917 14x-0.007 93，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 49，說明葡萄糖質(zhì)量濃度和吸光度值二者線性關(guān)系良好。

2.2機酸含量標準曲線的建立

采用高效液相色譜法對有機酸標準液進行分析，有機酸標準回歸方程、檢出限、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）及回收率結(jié)果見表1。

表1　有機酸的回歸方程、檢出限、RSD和回收率情況Table 1 Regression equa tion，detection lim it，RSD and recovery rate of organic acids

由表1可知，該方法所得各有機酸回歸方程的線性相關(guān)性好，定量準確、反應靈敏、重現(xiàn)性好、回收率高，適合作為木醋桿菌發(fā)酵液中有機酸的分析。

2.3同增效因子對細菌纖維素產(chǎn)量的影響

木醋桿菌產(chǎn)BC的合成過程大致可分為4個步驟：聚合、分泌、組裝、結(jié)晶［10］。細菌在發(fā)酵前期主要依靠磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）提供生產(chǎn)菌體的前體物和能量［11］；發(fā)酵后期通過PPP和TCA循環(huán)產(chǎn)生較多無效循環(huán)，則BC產(chǎn)量不再增加［12］。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照，各增效因子對BC產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖2。

圖2　添加不同增效因子后發(fā)酵液中細菌纖維素產(chǎn)量Fig．2 Bacte rial cellulose yield in ferm entation liquor after adding different synergistic factors

由圖2可知，添加增效因子后，細菌纖維素產(chǎn)量均有所提高。其中，添加10%玉米漿后BC產(chǎn)量最高，為8.534 g/L，與空白相比，提高了4.67倍；其次是添加60%椰子水后BC產(chǎn)量為6.008 g/L，與空白相比，提高了2.99倍；其他增效因子對BC產(chǎn)量影響不大。結(jié)果表明，10%玉米漿和60%椰子水對細菌纖維素產(chǎn)量的增效作用明顯。

2.4加不同增效因子后發(fā)酵液內(nèi)總糖和總酸的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照，各增效因子對發(fā)酵液中總糖和總酸含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3　添加不同增效因子后培養(yǎng)基內(nèi)總糖（A）和總酸（B）含量變化Fig．3 Changes of totalsugar（A）and totalacid（B）content in culture medium after adding different synergistic factors

由圖3A可知，除添加椰子水以外的其他試驗組總糖含量變化趨勢基本一致，前3 d快速下降，而后趨于平穩(wěn)，這可能是由于發(fā)酵前期木醋桿菌大量繁殖生長，對糖源消耗大，而發(fā)酵后期，木醋桿菌生長速度減慢，死亡率增加，菌體少繁殖或不繁殖，或是生成的BC將部分微生物包裹，所以對糖源的消耗也逐漸減少。而添加60%椰子水試驗組總糖含量一直處于快速下降趨勢，發(fā)酵結(jié)束時是其他實驗組總糖含量的一半，這可能是由于其內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，或營養(yǎng)配比更適合菌體生長，促進了細胞的生長代謝，使微生物細胞一直保持較高活性。因此，添加60%椰子水，可以促進糖源物質(zhì)的大量消耗，總糖含量降低，總糖消耗率最大（見表2），有利于木醋桿菌合成BC。

表2　添加不同增效因子后發(fā)酵液內(nèi)總糖消耗率Table 2 Consum ption rate of totalsugar in fermentation liquor after adding different synergistic factors

圖4　添加椰子水（A）、玉米漿（B）、Tween-80（C）、CMC（D）、煙酸（E）和生物素（F）培養(yǎng)基內(nèi)有機酸含量的變化Fig．4 Changes of organic acids content in m edium a fter adding coconutwater（A），corn steep liquor（B），Tween-80（C），CMC（D），nicotinic acid（E）and biotin（F）

由表2可知，添加60%椰子水試驗組總糖消耗率最大，為66.12%；添加10%玉米漿試驗組總糖消耗率為40.88%；而其余組總糖消耗率在30%左右。由此可見，總糖消耗率與各增效因子對BC的增效作用基本一致，總糖消耗率大，BC產(chǎn)量也較高。

由圖3B可知，與空白組相比，添加各增效因子后發(fā)酵液內(nèi)總酸變化基本一致，整體均呈下降趨勢。這可能是因為木醋桿菌將培養(yǎng)基內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)化為酸性物質(zhì)，使總酸含量上升，隨著發(fā)酵的進行，部分酸性物質(zhì)又被木醋桿菌利用，BC不斷生成，總酸含量不斷下降，發(fā)酵后期菌體衰亡、生物活性降低，總酸含量趨于穩(wěn)定。

2.5加不同增效因子后發(fā)酵液內(nèi)有機酸含量的變化

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照，各增效因子對發(fā)酵液中有機酸含量的影響結(jié)果見圖4?；A(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)有機酸含量的變化見圖5。

圖5　基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)有機酸的變化Fig.5 Changes of organic acids content in the basicmedium

由圖4和圖5可知，各添加增效因子培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸4種有機酸含量相當，且變化不明顯；葡萄糖酸、乳酸、乙酸和丁二酸是主體酸，各培養(yǎng)基主體酸種類基本一致，但含量差異很大。10%玉米漿試驗組有機酸含量最高，約是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的10倍，這與玉米漿對BC產(chǎn)量較為明顯的增效作用有一定關(guān)系。比較同一培養(yǎng)基內(nèi)各有機酸含量可知，乙酸含量差異很大，但均呈先增加后降低趨勢，這與戴銳等［13］研究結(jié)果相一致，并且與總酸變化趨勢一致，說明乙酸含量變化是導致總酸含量變化的重要因素，KIYOSHIT等［14］認為乙酸可以改變細菌纖維素的合成途徑，是有利于木醋桿菌合成BC的一種物質(zhì)。丁二酸和乳酸含量高，但變化不明顯，其與木醋桿菌合成BC關(guān)系不大，與張麗平等［15］研究結(jié)果相一致；葡萄糖酸含量最高、變化最明顯，變化趨勢各不相同，除添加玉米漿試驗組葡萄糖酸含量在后期呈快速降低外，其余試驗組在發(fā)酵后期均呈明顯的增加趨勢，且在整個發(fā)酵周期內(nèi)忽高忽低，這就說明葡萄糖酸在發(fā)酵過程中是微生物代謝產(chǎn)生的一種酸，其在培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)較充足時可被微生物利用，且在一定含量范圍內(nèi)有利于木醋桿菌合成BC，但發(fā)酵后期葡萄糖酸積累，木醋桿菌合成BC的能力也逐漸降低。

3　結(jié)論

本研究在木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素培養(yǎng)基中，添加一定量椰子水、玉米漿、Tween-80、羧甲基纖維素（CMC）、煙酸和生物素等增效因子，在發(fā)酵周期內(nèi)，測定發(fā)酵液中BC產(chǎn)量、總糖、總酸以及有機酸含量。結(jié)果表明，添加增效因子后發(fā)酵液中細菌纖維素產(chǎn)量、總糖消耗率、平均總酸和有機酸含量均有所增加，其中，玉米漿的增效作用最強，細菌纖維素產(chǎn)量為8.534 g/L，與空白組相比，增加了4.67倍；椰子水對發(fā)酵液中的總糖消耗率最大，為66.12%。各增效因子對總糖和總酸增效作用與BC產(chǎn)量的變化存在一定的相關(guān)性，即對發(fā)酵液總糖總酸增效作用強，則BC產(chǎn)量高。對發(fā)酵液內(nèi)有機酸含量的變化進一步研究表明，葡萄糖酸、乙酸、乳酸和丁二酸含量較高且變化較為明顯，是發(fā)酵過程中的主體酸。其中，乙酸含量變化與總酸含量變化趨勢一致，是導致總酸含量變化的重要因素，有利于木醋桿菌合成BC，添加玉米漿后，發(fā)酵液中4種主體酸所占比例最大，為90%以上。有機酸的最適添加濃度以及總糖、總酸的增效機理將在后續(xù)的試驗中繼續(xù)研究，為BC的實際生產(chǎn)提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

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Effect of synergistic factor on the substances change of fermentation liquid with bacterial cellulose-producing Acetobacter xylinum

JIA Qinghui1，LU Hongmei1，2*，CHEN Li2，ZHANG Liping2
（1.School ofChem istry and Chem ical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000，China；2.SchoolofLiquorand Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000China）

A certain amountof synergistic factorswere added into the culturemedium of bacterial cellulose-producing Acetobacter xylinum.The effectof coconutwater，corn steep liquor，Tween-80，CMC，niacin and biotin on bacterial cellulose（BC）yield and the contentof totalsugar，totalacid and organic acid were investigated.The resultsshowed that10%corn steep liquor and 60%coconutwater had the strongesteffecton BC yield，and the BC yield were 8.534 g/L and 6.008 g/L，respectively.Compared w ith the blank group，it increased by 4.67 and 2.99 times respectively.Adding 60%coconutwater could reduce total sugar contentsand promote A.xylinum synthesizing BC.A fter adding synergistic factors，the changesof total acid contentwere almost in the same，and appeared a decreasing trend.In the test group of 10%corn steep liquor，the organic acid contentwas the highest，and the proportion of glucose，lactic acid，acetic acid and butyl acid was the largest，which had a certain relationship w ith the effectof 10% corn steep liquoron BC yield.

bacterialcellulose；total sugar；totalacid；organic acid；synergistic factor

Q815

0254-5071（2016）01-0014-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．004

2015-09-11

國家自然科學基金（31160338）；貴州省科學技術(shù)基金（黔科合字［2010］2066）

賈青慧（1991-），女，碩士研究生，研究方向為生物質(zhì)資源化利用。

盧紅梅（1967-），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程以及食品科學。