王　勇，劉　斌

(1. 徐州醫(yī)學院，江蘇 徐州 221042；2. 徐州醫(yī)學院附屬連云港市東方醫(yī)院，江蘇 連云港 222042；3. 徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221042)

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HCV核心蛋白對肝癌細胞系SMMC-7721增殖作用的研究

王勇1，2，劉斌3

(1. 徐州醫(yī)學院，江蘇 徐州 221042；2. 徐州醫(yī)學院附屬連云港市東方醫(yī)院，江蘇 連云港 222042；3. 徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221042)

[摘要]目的探討HCV核心蛋白對肝癌細胞系SMMC-7721的增殖作用。方法將空載質粒(對照組)和HCV核心蛋白重組質粒(實驗組)分別轉染肝癌細胞系SMMC-7721，提取轉染后細胞RNA、蛋白質，比較2組細胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白表達水平，收集轉染細胞上清液，ELLSA檢測2組細胞上清液HCV核心蛋白表達差異，采用MTT檢測2組細胞增殖率，并采用transwell檢測2組細胞侵襲和遷移情況。結果實驗組細胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)，同時實驗組細胞上清液HCV核心蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)；實驗組細胞增殖率明顯高于對照組(P<0.05)；實驗組細胞侵襲細、遷移細胞數(shù)均明顯高于對照組(P均<0.05)。結論HCV核心蛋白能夠顯著提高肝癌細胞系SMMC-7721增殖、侵襲及遷移。

[關鍵詞]HCV核心蛋白；肝癌細胞；增殖；侵襲；遷移

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)核心蛋白是由HCV RNA核心區(qū)編碼的多功能蛋白，該病毒有包膜，是單股正鏈RNA病毒。HCV病毒的編碼區(qū)有且僅有一個開放閱讀框，能夠編碼3010—3030氨基酸序列蛋白前體。HCV核心蛋白共含有191個氨基酸，其既是病毒的核殼成分，又可調節(jié)病毒的啟動子活性[1-2]。在慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的致病過程中HCV核心蛋白具有重要致病作用，其可通過影響線粒體功能、細胞間的信號轉導及與宿主細胞蛋白的直接作用參與細胞增殖和凋亡，導致細胞周期異常[3-5]，但是HCV核心蛋白導致肝癌發(fā)生的機制仍不清楚。為了進一步研究HCV核心蛋白在肝癌發(fā)病中的機制，本研究使用HCV核心蛋白的重組質粒及空載質粒分別轉染人源肝癌細胞系SMMC-7721，檢測2組細胞及細胞上清HCV核心蛋白的表達量，同時檢測2組細胞的增殖能力，分析比較2組細胞的增殖能力差異，探究HCV核心蛋白對肝癌細胞增殖的影響。

1實驗資料

1.1實驗材料SMMC-7721細胞系：購自上海生命科學研究所，在DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)+胎牛血清10%(美國Gibco公司)，37 ℃，2.5% CO2孵箱中培養(yǎng)；質粒：重組質粒pcDNA3.0-C-EGFP及空載質粒pcDNA3.0(-)購于上海生命科學研究所；HCV核心蛋白ELLSA檢測試劑盒、MTT細胞增殖檢測試劑盒、Transwell小室購于南京建成生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞轉染于轉染前24 h將SMMC-7721細胞(2×105mL-1)接種在6孔板采用Lipofectamine 2000將重組質粒和空載質粒轉入細胞，轉染48 h后提取細胞RNA，轉染72 h后提取細胞蛋白。

1.2.2HCV核心蛋白mRNA表達的檢測轉染48 h后采用Trizol提取2組細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒按1 μg 將RNA逆轉錄成cDNA，RT-PCR檢測HCV核心蛋白mRNA表達水平，HCV核心蛋白引物：上游5’-CGCGGATCCATGAGCACAAATCC-3’，下游5’-CCGGAATTCGCAACCGGGC-3’; GAPDH:上游5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’；反應體系(20 μL)：SYBR染料10 μL，ddH2O 8.6 μL，上游0.6 μL，下游0.6 μL，cDNA 0.2 μL。

1.2.3HCV核心蛋白表達的檢測采用Western blot檢測HCV核心蛋白表達水平，于轉染72 h后提取2組細胞蛋白，每孔蛋白上樣量40 μg，電泳、轉膜、封閉(BSA)，1∶1 000稀釋HCV核心蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBS-T洗滌3遍，每遍15 min，加入二抗(兔抗)常溫孵育2 h，顯影液顯色，以β-actin為內參。

1.2.4培養(yǎng)液上清HCV核心蛋白的檢測于轉染72 h收集細胞培養(yǎng)液上清(100 μL)，于96孔板中4 ℃孵育過夜，硝酸鹽緩沖液洗滌3次，37 ℃封閉1 h，TBS-T洗滌3次，HCV核心蛋白一抗(10 μL/孔)，37 ℃孵育1 h，將96孔板內液體吸干，TBS-T洗滌3次，采用ELISA試劑盒檢測表達量。

1.2.5細胞增殖率的檢測將轉染72 h的細胞種于96孔板，采用MTT方法檢測2組細胞增殖情況，于570 nm波長下檢測吸光度值，每組細胞設置6個復孔，且平行進行3次試驗。增殖率=(實驗組-對照組)/對照組×100%。

1.2.6細胞侵襲和遷移的檢測將100 μL Matrigel加置于transwell上室，37 ℃，2 h。加入轉染72 h的細胞(1×105mL-1)懸液，于下室加完全培養(yǎng)基，置于孵箱內培養(yǎng)48 h，去除上室Matrigel及未侵襲的細胞。采用多聚甲醛固定細胞10 min，Giemsa染色15 min，于顯微鏡下(200×)記錄侵襲細胞數(shù)，每孔取8個視野的平均值。

1.3統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.12組HCV核心蛋白mRNA及蛋白表達水平比較實驗組細胞HCV核心蛋白mRNA及蛋白水平均顯著高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1　2組HCV核心蛋白mRNA和蛋白

注：①與對照組相比，P<0.05。

2.22組細胞培養(yǎng)上清液HCV核心蛋白表達水平比較實驗組細胞上清液HCV核心蛋白表達水平為(4.61±1.09)μg/mL，對照組為(14.78±2.33)μg/mL，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.32組細胞增殖率比較實驗組細胞增殖率為(49.6±6.7)%，對照組為(19.8±2.5)%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.42組細胞侵襲、轉移情況比較實驗組侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)均明顯高于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　2組細胞侵襲、轉移情況比較±s，104個)

注：①與對照組相比，P<0.05。

3討論

HCV核心蛋白與其他HCV蛋白相比，氨基酸序列高度保守，是組成病毒核衣殼的重要結構蛋白[6]。HCV核心蛋白除形成核衣殼外，還可與病毒本身或宿主細胞內的蛋白質結合，形成二聚體或多聚體，調節(jié)病毒自身及宿主某些蛋白質的轉錄及翻譯過程[7-8]。HCV核心蛋白結合重要調節(jié)蛋白，能夠直接影響宿主細胞信號轉導、細胞凋亡、脂質代謝等過程，因此HCV核心蛋白與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切[9]。有研究表明在HepG2細胞系中HCV核心蛋白可通過抑制Jak-STAT通路的活化，下調ISGF-3水平，從而降低IFN-α的產生和應答，這與IFN-α在HCV感染治療中臨床應答率低息息相關[10]。HCV核心蛋白參與調節(jié)細胞凋亡信號通路，并誘導、抑制凋亡，如死亡受體Fas家族、Bcl-家族等；HCV-core是HCV蛋白的核心，其各種亞型均高度保守[11-12]。HCV核心蛋白參與了細胞的信號轉導、脂質代謝，同時影響著細胞的死亡、凋亡以及增值。細胞維持正常生長發(fā)育的重要條件就是細胞周期，多種蛋白參與調控細胞生長周期，包括p53、p21、pRb、E2f、c-Myc、cyclin D等，十分復雜[13]。相關研究表明，HCV核心蛋白能夠影響細胞生長周期，但是實驗條件不同或使用的細胞品系不同，所得到的結果也不盡相同。此外，HCV核心蛋白能顯著激活Wnt/β信號通路，從而促進肝癌細胞系SMMC-7721的增長[14]。

肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的主要過程是慢性肝炎、肝硬化、肝癌，HCV的慢性持續(xù)感染能夠引起慢性肝炎、肝硬化，但是HCV是如何誘發(fā)肝臟疾病呢？相關研究表明，HCV核心蛋白能夠破壞細胞的生長周期，導致細胞在分裂時滯留在G1期，無法進入S期，從而使得HCV能夠潛伏在G0/G1期的細胞內，G0期的細胞能夠維持長期不增殖的狀態(tài)，導致細胞長期處于HCV病毒感染的狀態(tài)，這樣宿主細胞會不斷地被損傷，甚至發(fā)生基因突變[15]。但是當宿主細胞被某些生長因子或其他增殖信號激活，又能夠進入S期進行增殖，導致大量HCV病毒被不斷地復制，最終誘發(fā)慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌[16-17]。

本研究重點集中在HCV核心蛋白對人肝癌細胞系SMMC-7721增殖的作用，將HCV核心蛋白重組質粒及空載對照質粒分別轉入細胞，檢測細胞HCV核心蛋白表達情況，觀察轉入HCV核心蛋白后SMMC-7721的增殖、侵襲及遷移能力的變化。本研究提取轉入HCV核心蛋白質粒組細胞和空轉質粒組細胞的蛋白和RNA，Western Blot 及RT-PCR結果顯示，HCV核心蛋白mRNA、蛋白表達水平均明顯高于空載組細胞。此外本研究采用ELLSA試劑盒檢測2組細胞上清HCV核心蛋白含量，結果顯示實驗組細胞上清HCV核心蛋白也明顯高于對照組，且差異有顯著統(tǒng)計學意義。以上實驗結果在蛋白水平和RNA水平上證實本研究采用的HCV核心蛋白質粒能夠穩(wěn)定表達HCV核心蛋白。本研究采用MTT檢測2組細胞的增殖能力，結果顯示，實驗組細胞增殖率明顯高于對照組；Transwell結果顯示，實驗組細胞侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)均明顯高于對照組，表明當SMMC-7721細胞表達HCV核心蛋白后，其增殖及遷移能力均較對照組大大增強。

綜上所述，HCV核心蛋白能顯著促進SMMC-7721細胞增殖、侵襲及遷移能力，因此可推斷，HCV核心蛋白感染與肝癌發(fā)生發(fā)展關系密切。將研究目光聚焦在HCV核心蛋白表達量上或許能為將來臨床治療慢性肝炎、肝硬化或肝癌提供新的治療靶點。然而肝癌患者的臨床治療預后較差，手術和化療以及生物治療均是治療肝癌患者的重要治療方式，因此肝癌的治療是一個綜合治療的過程，不斷改進和完善這個綜合治療的每個環(huán)節(jié)是提高肝癌患者臨床療效并進一步改善患者預后的基礎，而目前手術和化療方面的治療手段已經相對成熟，較難取得突破，微觀生物治療是目前研究的熱點，需要臨床同仁進一步探索，一方面對于了解和掌握肝癌的發(fā)病和病情進展機制具有重要意義，另一方面可以為臨床評估肝癌患者的病情及指導臨床治療方案提供幫助和參考。

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doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.21.020

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)21-2337-03

[收稿日期]2015-12-10