任　爽,張　杰

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110001)

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論著

毛蕊異黃酮抗肝星狀細胞活化的作用機制研究

任爽,張杰

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院， 遼寧 沈陽 110001)

[摘要]目的觀察毛蕊異黃酮對TGF-β1/Smads信號通路的影響，探討毛蕊異黃酮抗肝星狀細胞活化的作用機制。方法以人肝星狀細胞株(LX-2)為研究對象，采用高內涵系統(tǒng)觀察細胞增殖 (EdU)及細胞內F-actin骨架的聚合情況，RT-PCR法檢測細胞I型膠原(Col-Ⅰ)、α-SMA、 TGF-β1 mRNA表達水平，Wstern-blot法檢測細胞內p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表達水平。結果TGF-β1可顯著促進LX-2細胞增殖、活化，EdU陽染細胞明顯增加，α-SMA、TGF-β1、p-Smad2及Col-Ⅰ mRNA 或蛋白表達顯著增加(P均<0.05)，Smad7表達顯著下降；毛蕊異黃酮可顯著降低TGF-β1誘導的LX-2中EdU陽染細胞率以及α-SMA、p-Smad2與 Col-Ⅰ的mRNA或蛋白表達(P均<0.05)，顯著提高Smad7蛋白表達，且作用與TβRI激酶抑制劑SB-431542相當。結論毛蕊異黃酮可顯著抑制肝星狀細胞活化，其機制與抑制TGF-β1、p-Smad2的表達，提高Smad7蛋白表達，進而抑制TGF-β1/Smads信號轉導有關。

[關鍵詞]毛蕊異黃酮，肝纖維化，肝星狀細胞，TGF-β1/Smads 信號通路

肝纖維化是組織損傷導致的愈合反應，是諸多慢性肝病發(fā)展為肝硬化的重要病理過程?，F代分子生物學研究發(fā)現，肝星狀細胞(HSC)的活化及表型改變是其核心事件，轉化生長因子(TGF)-β1是致纖維化的關鍵細胞因子。TGF-β1的生物學效應是通過其激活的下游信號如Smads蛋白轉導通路，其作用于靶基因，能促進膠原的合成[1]。黃芪是一味常用的傳統(tǒng)中藥，其可用于治療各類慢性肝病，而毛蕊異黃酮(CA)是從黃芪中提取的單體成分，被認為是黃芪黃酮類主要活性成分，其具有明確的抗氧化作用[2-3]。本研究以人肝星狀細胞株LX-2為研究對象，觀察CA對肝星狀細胞活化的影響，旨在闡釋其調控TGF-β1/Smads信號通路的作用機制。

1實驗資料

1.1細胞人肝星狀細胞株LX-2 獲贈于上海中醫(yī)藥大學。

1.2藥物CA為西安鴻生生物技術有限公司產品，含量≥90%，采用中藥指紋圖譜質量監(jiān)控技術控制質量。

1.3主要試劑轉化生長因子受體(TβR)-Ⅰ激酶抑制劑 SB-431542, 購自TOCRIS Bioscience(USA)；重組人TGF-β1(reconstituted with sterile 4 mmol/L HCl containing 1 mg/mL BSA toa final concentration of 1 μg/mL) 購自R&D Systems(USA)； DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibico(USA)；EDU細胞增殖試劑盒，購自廣州銳博科技有限公司；兔單克隆I型膠原抗體,購自SIGMA-ALDRICH(USA)；兔單克隆抗體抗磷酸化Smad2、Smad2,購自CST公司(USA)；兔單克隆抗體抗Smad7抗體,購自Epetomics；RNA提取試劑盒及First strand cDNA 合成試劑盒,購自Fermentas, St. Leon-Roth(德國)；SYBR Green Real Time PCR 試劑盒,購自TakaRa Biotech(日本)； RT-PCR引物序列由大連寶生物設計合成。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng)與處理LX-2細胞培養(yǎng)于5% CO2、濕度95%、10%FBS/高糖DMEM,18 h后更換為含0.5%血清的DMEM孵育。

1.4.2細胞活力檢測實驗分為對照組及CA 30，60，120，240，480 μmol/L組。將1.4.1正常培養(yǎng)18 h后的LX-2細胞5 000個/孔接種于96孔板，對照組培養(yǎng)液為0.5%FBS/DMEM，CA各組加入不同濃度的CA藥液，經過24 h孵育后，棄培養(yǎng)液，加入0.5 mg/mL MTT液，孵育4 h，小心吸棄工作液，加入DMSO 100 μL/孔至充分溶解，于酶標儀490 nm吸收波長檢測吸光值。

1.4.3高內涵多指標細胞毒性檢測實驗分為對照組及CA 30，60，120，240 μmol/L組。將1.4.1正常培養(yǎng)18 h后的LX-2 細胞5 000個/孔接種于96孔板，對照組培養(yǎng)液為0.5%FBS/DMEM，CA各組加入不同濃度的CA藥液，經過24 h孵育后，棄培養(yǎng)上清，每孔加入40 μL預熱(37 ℃)的通透性染液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。吸棄通透性染液，每孔加入50 μL預熱的4%甲醛固定液，室溫下置通風柜內固定15 min。吸棄固定液，PBS洗滌2次，每孔加50 μL細胞核染液室溫避光孵育5 min，吸棄染核液，PBS洗滌2次，每孔加入200 μL PBS，ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Multiparameter Cytotoxicity Bio Application Software對圖像進行分析。

1.4.4高內涵EdU摻入法細胞增殖檢測實驗分為對照組、TGF-β1(2.5 ng/mL)組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+CA 30 μmol/L組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA 60 μmol/L組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA 120 μmol/L組。將1.4.1正常培養(yǎng)18 h后的LX-2 細胞5 000個/孔接種于96孔板，在相應條件下孵育24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μmol/L EdU溶液100 μL孵育2 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.2%甘氨酸孵育10 min，PBS洗5 min×2次，0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗5 min，Appllo ?染色反應液避光孵育30 min，PBS洗5 min，0.5% Triton X-100 孵育10 min×3次，Hoechst避光孵育10 min，PBS洗5 min×2次，ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Cell Health Profiling BioApplication Software 對圖像進行分析。

1.4.5高內涵細胞免疫熒光染色實驗分組同1.4.4，孵育結束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌，以0.5% Triton X-100 孵育10 min，F-actin 染色37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，滴加DAPI染核5 min，PBS洗滌，ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Cell Health Profiling BioApplication Software 對圖像進行分析。

1.4.6LX-2細胞中α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表達檢測采用Real-time PCR法檢測。實驗分為對照組、TGF-β1(2.5 ng/mL)組、TGF-β1(2.5 ng/mL)+ CA(120 μmol/L)組、TGF-β1(2.5 ng/mL) + SB-431542(10 μmol/L)組，各組LX-2細胞在相應條件下培養(yǎng)24 h后，參照RNeasy Mini Kit操作說明提取RNA，檢測RNA濃度及完整性，按照逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA 合成，-20 ℃保存?zhèn)溆?。Real-time PCR在Rotor-Gene 3000或ABI完成，PCR反應體系為cDNA 1 μL，SYBR Green 10 μL，引物2 μL，雙蒸水7 μL。反應條件為95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.4.7LX-2細胞中p-Smad2、Smad2、Smad7蛋白表達檢測采用Wstern-blot法檢測。實驗分組同1.4.6，各組LX-2細胞在相應條件下培養(yǎng)24 h后采用RIPA緩沖液裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠(濃度8%～10%)電泳，轉移至硝酸纖維膜。5%脫脂奶粉封閉，第一抗體4 ℃孵育過夜，紅外染料標記的第二抗體室溫下孵育1 h，采用Odyssey紅外掃描儀掃描、分析蛋白條帶。

2結果

2.1CA對LX-2細胞活力的影響MTT實驗檢測顯示，與對照組相比，240 μmol/L和480 μmol/L CA對細胞增殖具有顯著抑制作用(P均<0.05)，提示兩濃度可能對細胞具有毒性作用。見圖1。

2.2CA對LX-2細胞毒性的影響CA 240 μmol/L組孵育24 h細胞膜通透性明顯高于對照組(P<0.05)，提示有細胞毒性；而CA其他組細胞膜通透性與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，表明對細胞無毒性作用 。見圖2。

2.3CA對LX-2細胞增殖的影響TGF-β1可顯著促進LX-2細胞的增殖，EdU陽染細胞比率明顯高于對照組(P<0.05)；而TGF-β1+ CA 120 μmol/L組EdU陽染細胞比率顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，提示120 μmol/L CA 可以顯著抑制TGF-β1誘導的LX-2細胞增殖。見圖3～8。

2.4CA對LX-2細胞表達F-actin的影響高內涵檢測見到，LX-2在TGF-β1的刺激下，其細胞內F-actin聚合成粗大的纖維束，沿細胞長軸平行排列，分布均勻，呈明顯活化狀態(tài)；而TGF-β1+ CA120 μmol/L組F-actin染色明顯變淡、模糊，分布不均，見圖 9～13。各組骨架平均熒光值變化與圖片觀測趨勢一致，見圖14。提示TGF-β1誘導了明顯的LX-2活化，而120 μmol/L CA可以有效抑制TGF-β1引起的LX-2活化。

圖1　各組LX-2 細胞活力

圖2　各組LX-2 細胞膜通透性

圖3　各組LX-2 細胞增殖情況

圖4　對照組LX-2細胞增殖染色表現

圖5　TGF-β1組LX-2細胞增殖染色表現

圖6　TGF-β1+ CA 120 μmol/L組LX-2細胞增殖染色表現

圖7　TGF-β1+ CA 60 μmol/L組LX-2細胞增殖染色表現

圖8　TGF-β1+ CA 30 μmol/L組LX-2細胞增殖染色表現

圖9　對照組LX-2細胞中F-actin表達情況

2.5CA對TGF-β1誘導LX-2細胞表達α-SMA、Col-Ⅰ 和TGF-β1mRNA的影響TGF-β1組α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，TGF-β1+ CA 120 μmol/L組α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA和TGF-β1mRNA表達量均明顯低于TGF-β1組(P均<0.05)，與SB-431542組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖15～17。

圖10　TGF-β1組LX-2細胞中F-actin表達情況

圖11　TGF-β1+ CA 120 μmol/L組LX-2細胞中

圖12　TGF-β1+ CA 60 μmol/L組LX-2細胞中F-actin表達情況

圖13　TGF-β1+ CA 30μmol/L組LX-2細胞中F-actin表達情況

2.6CA對LX-2細胞中p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表達的影響各組Smad2蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義，但TGF-β1可顯著促進p-Smad2蛋白表達，引起Smad7的蛋白表達下調；120 μmol/L CA和SB-431542可以顯著抑制p-Smad2蛋白的表達，顯著提高Smad7蛋白的表達。見圖18。

圖14　各組骨架平均熒光值

圖15　各組LX-2細胞中α-SMA mRNA表達量

圖16　各組LX-2細胞中Col-Ⅰ mRNA表達量

圖17　各組LX-2細胞中TGF-β1 mRNA表達量

3討論

肝纖維化指肝纖維組織彌漫性增生，抑制肝纖維化可以有效防治肝硬化、肝癌的發(fā)生。肝星狀細胞的活化在肝纖維化進展中發(fā)揮著重要作用，活化的肝星狀細胞是肝纖維化中ECM的主要來源。抑制肝星狀細胞的激活、增殖及膠原合成，對肝纖維化防治有重要價值[4-7]。F-actin可反映肝星狀細胞活化程度，而α-SMA和Col-Ⅰ表達增加提示肝星狀細胞活化、肝纖維進展。

圖18　各組LX-2細胞中p-Smad2、Smad2及Smad7蛋白表達情況

TGF-β1是肝纖維化發(fā)生的重要刺激因子，促進肝星狀細胞的活化，而TGF-β1生物效應的發(fā)揮必須通過特定的信號轉導過程，該過程已基本明了。TGF-β1胞外激活后，與其胞膜上特異性受體(TGF-β type Ⅰ/Ⅱ Receptor,TβRⅠ/Ⅱ)結合，繼而主要由 Smad蛋白介導胞內信號傳遞。Smad蛋白分為3類：①受體調控型，與TGF-β1信號轉導相關的是Smad2/3；②共同型，主要是Smad 4；③抑制型， Smad7等。Smad2/3是TβRⅠ型受體胞內激酶的特異性底物，經受體激酶磷酸化后與Smad 4結合，轉位細胞核內，調控細胞目的基因表達，在TGF-β1胞內信號轉導中起關鍵作用。Smad7作為該通路負性調控因子，主要通過與TβR-Ⅰ結合，阻止Smad蛋白的磷酸化，進而抑制了TGF-β/Smad通路的信號傳導[8-9]。

目前尚缺乏有效的抗肝纖維化化學藥物[10]。中醫(yī)藥治療慢性肝病具有悠久的歷史，已經有大量體內體外研究表明中藥復方或者中藥提取物可以有效對抗肝纖維化。而采用效應跟蹤、從復方及藥物化學組分及成分的角度探索復方物質基礎是當前該領域的重要研究思路之一[11]。黃芪湯(《普濟本事方》)又名黃芪六一湯(《太平惠民和劑局方》)，由黃芪、甘草、大棗3味藥組成，治諸虛不足、肢體勞倦、心中煩悸、唇口干渴、食少面黃，該方作為一古典方劑，廣泛應用于慢性肝病的治療中；多中心、隨機、雙盲、對照試驗以及動物實驗均提示其良好的抗肝纖維化作用[12-15]。本研究采用體外實驗，以TGF-β1刺激LX-2星狀細胞活化模型，應用SB-431542這一特異性TβR-Ⅰ激酶抑制劑作為陽性對照，選用有效且無毒劑量的CA(120 μmol/L)作為干預因素，實驗結果提示CA和SB-431542可以有效抑制TGF-β1引起的LX-2的增殖、活化，即下調EdU陽染細胞率及a-SMA、F-actin和Col-Ⅰ表達；顯著抑制TGF-β1、p-Smad2的表達，提高Smad7表達，提示CA影響TGF-β1刺激星狀細胞活化與抗纖維化的主要機制在于抑制TGFβ/Smads信號通路的轉導。本實驗雖已了解CA干預TGFβ/Smads信號通路轉導的部分重要作用，但是對于CA通過何種途徑抑制TGFβ1mRNA的轉錄，是否影響TGF-β1胞外激活與HSCs信號跨膜以及HSCs胞內其他信號分子等，尚需進一步研究，以期系統(tǒng)明確CA干預TGF-β1/Smads信號轉導的抗肝纖維化的關鍵作用機制。

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[作者簡介]任爽，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向為中醫(yī)藥抗肝纖維化基礎與臨床。 [通信作者]張杰，E-mail:zhangjie945@126.com

[基金項目]遼寧省科學技術廳自然科學基金項目(201202262)；遼寧省名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設項目

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.21.001

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)21-2281-05

[收稿日期]2016-02-15

Study on the mechanism of Calycosin in inhibition of hepatic stellate cell activation

REN Shuang, ZHANG Jie

(The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of Calycosin (CA) in the signaling pathway of TGF- β1/Smads, and investigate its mechanism of action in inhibition of hepatic stellate cell activation. Methods Human hepatic stellate cell line LX-2 cells were taken as the research object, the high content system was used to observe the cell proliferation (EdU) and the aggregation of F-actin skeleton in the cell, RT-PCR method was used to detect the mRNA expression levels of collagen type I (Col-Ⅰ), α-SMA and TGF-β1, Wstern-blot method was used to detect the protein expression levels of p-Smad2, Smad2 and Smad7 in the cell. Results Compared to the control, the proliferation and activation of LX-2 was significantly promoted by TGF-β1, and the expression of mRNA or protein of EdU, F-action, α-SMA, TGF-β1, p-Smad2, Col-Ⅰ were significantly increased (all P<0.05), as well as the Smad7 was significantly decreased (P<0.05). The rate of EdU positive cells in LX-2 induced by TGF-β1 and the mRNA or protein expression of α-SMA, p-Smad2 and Col-Ⅰ were significantly reduced by CA (all P<0.05), and the expression of Smad7 protein was significantly increased (P<0.05), and the role was equivalent to TβRI kinase inhibitor SB-431542. Conclusion CA can significantly inhibit the activation of hepatic stellate cells, the mechanism is related to inhibiting the expression of TGF-β1 and p-Smad2, enhancing the expression of Smad7 protein, and then inhibiting the signal transduction of TGF-β1/Smads.

Key words:Calycosin; liver fibrosis; hepatic stellate cell; signaling pathway of TGF-β1/Smads