李改艷，劉小丹，張琳娜

(1.陜西順天醫(yī)藥有限公司，西安　710077；2.陜西新民生醫(yī)藥有限公司，西安　710026)

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款冬花多糖功能飲料的制備及其抗氧化能力測(cè)定

李改艷1，劉小丹1，張琳娜2

(1.陜西順天醫(yī)藥有限公司，西安710077；2.陜西新民生醫(yī)藥有限公司，西安710026)

摘要：目的研究款冬花多糖功能飲料的最佳制備工藝，并測(cè)定其抗氧化能力。方法采用正交實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)功能飲料的制備工藝，用·DPPH試劑測(cè)定功能飲料的抗氧化性。結(jié)果款冬花多糖功能飲料的最佳配比為款冬花多糖60 g、砂糖8 g、檸檬酸0.24 g和β-環(huán)糊精0.2 g，此條件下制備的功能飲料口感良好，易于接受。結(jié)論得到一條適用于款冬花多糖功能飲料制備的工藝路線，并測(cè)得該多糖功能飲料具有明顯的抗氧化性。

關(guān)鍵詞：款冬花；多糖；功能飲料；·DPPH抗氧化性

功能飲料是指通過(guò)調(diào)整飲料中天然營(yíng)養(yǎng)素的成分和含量比例，以適應(yīng)某些特殊人群營(yíng)養(yǎng)需要的飲品，其成分與人體體液相似，飲用后可被迅速吸收，及時(shí)補(bǔ)充人體因大量運(yùn)動(dòng)出汗所損失的水分和電解質(zhì)，使體液達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，功能飲料成為目前廣大人群接受的健康飲品。中藥款冬花[1]為菊科植物款冬(FlosFarfarae)的干燥花蕾，主產(chǎn)于陜西、山西、甘肅和河南等地，其花含款冬二醇等甾醇類、蕓香苷、金絲桃苷、三萜皂苷、鞣質(zhì)、蠟、揮發(fā)油、菊糖、硬脂酸、棕櫚酸甘油酯、酒石酸、蘋(píng)果酸、轉(zhuǎn)化糖、膽堿和碳?xì)浠衔?；其味辛，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下主治咳逆上氣善喘、喉痹、肺痿肺癰和吐膿血等疾病；始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為常用中藥材之一；具有潤(rùn)肺止咳和化痰平喘之功效。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)款冬花的研究主要集中在萜類、黃酮、生物堿、有機(jī)酸和精油等化學(xué)成分，對(duì)多糖類成分的研究相對(duì)較少，也鮮見(jiàn)有關(guān)款冬花多糖[2]抗氧化性方面的報(bào)道。為更好地開(kāi)發(fā)和利用這一藥用資源，本實(shí)驗(yàn)擬將款冬花多糖開(kāi)發(fā)[3]為一種新型功能飲料，并采用·DPPH試劑法檢測(cè)款冬花多糖清除自由基的能力，為合理地利用款冬花多糖這一生物活性成分提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器UV-265紫外分光光度儀(SB3200DT，日本島津公司)；BSAL204電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；HHS112電熱恒溫水浴鍋(江蘇省醫(yī)療器械廠)；SHZD Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(振洲長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)；XMTD電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；KQ2100超聲清洗器(寧波新藝生物科技股份有限公司)；SHB-B95真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司)。

1.2試藥款冬花；葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：20140208，天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司)；濃硫酸、鄰苯三酚和無(wú)水乙醇等試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑陜西有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為純化水(西安萬(wàn)隆制藥股份有限公司)。

2方法

2.1款冬花多糖的提取方法[4-5]取干凈、無(wú)霉變的生品款冬花蕾，除去枝干和石塊等雜物，用清水沖去表面灰塵及泥土后瀝干，干燥。用剪刀剪碎款冬花花蕾，浸泡24 h后進(jìn)行超聲提取。

2.2多糖提取單因素結(jié)果與分析

2.2.1提取溫度對(duì)款冬花多糖提取率的影響固定液料比為21 mL·g-1，提取時(shí)間為6 h，用3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，考察不同的提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)溫度分別為25，28，30和32 ℃時(shí)，款冬花多糖的提取率依次為5.31%，7.54%，10.61%和9.35%。由此可知，隨著溫度的升高，多糖提取率增加，在超聲提取下30 ℃時(shí)達(dá)到最高值，之后隨溫度上升，多糖提取率有下降趨勢(shì)。其原因可能與多糖本身的穩(wěn)定性有關(guān)，高溫提取可能會(huì)導(dǎo)致多糖降解，從而引起多糖提取率下降；此外，超聲頻率對(duì)多糖提取也有影響。2.2.2提取時(shí)間對(duì)款冬花多糖提取率的影響固定液料比為15 mL·g-1、溫度為30 ℃，考察不同的提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)時(shí)間分別為4，6，8和10 h時(shí)對(duì)應(yīng)的款冬多糖提取率依次為5.62%，9.61%，9.83%和8.62% 。由結(jié)果數(shù)據(jù)可知，多糖提取率在4～6 h之間上升比較明顯，以后趨于平緩。8 h以后，提取率有了較明顯的下降趨勢(shì)，這可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，在提取溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，多糖出現(xiàn)了降解反應(yīng)，從而影響了多糖的提取率，因此超聲提取時(shí)間應(yīng)控制在6～8 h之間。

2.2.3液料比對(duì)款冬花多糖提取率的影響在溫度為30 ℃時(shí)，提取3次，時(shí)間6 h，考察不同的液料比對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果顯示：當(dāng)液料比分別為15，18，21和24 mL·g-1時(shí)，對(duì)應(yīng)的提取率依次為6.65%，9.61%，10.14%和9.553%。通過(guò)分析數(shù)據(jù)可知，液料比在10～20 mL·g-1之間，多糖提取率上升較快，而液料比在21～24 mL·g-1之間呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著液料比的增加，款冬花花蕾中其他成分的溶出影響了多糖的溶出，因此液料比應(yīng)定在21 mL·g-1。

2.2.4醇沉體積比對(duì)多糖提取率的影響取上述多糖的提取液按照一定比例濃縮，濃縮后的提取液等體積分為4份，分別加入1，2，3和4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，靜置過(guò)夜，抽濾，抽去雜質(zhì)，得粗多糖，考察不同醇沉體積比對(duì)多糖提取率的影響。結(jié)果，當(dāng)醇沉體積比為1.5，2.0，2.5和3.0倍時(shí)，款冬花多糖提取率分別為5.38%，8.97%，10.60% 和9.76%，用2.5倍量體積的乙醇醇沉，得到的雜質(zhì)最多。因此，確定最佳的乙醇用量為多糖濃縮液體積的2.5倍。

2.3款冬花多糖的脫色稱取活性炭2 g，置于烘箱中干燥活化，30 min后取出，與款冬花多糖混合進(jìn)行脫色處理，過(guò)濾。

2.4款冬花多糖含量的測(cè)定方法將提取液置于90 ℃的水浴鍋中蒸發(fā)、濃縮9 h，放入烘箱中55 ℃干燥9 h，至款冬花多糖完全干燥。精密稱定質(zhì)量，為5.732 0 g。

款冬花多糖提取率(%)=(款冬花粗多糖質(zhì)量/款冬花干質(zhì)量)×100%

2.4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取在105 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品0.250 mg，置于250 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，稀釋至刻度，定容。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備量取上述溶液10 mL,置于100 mL 量瓶中，稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.4，0.6和0.8 mL，分別置于10 mL 量瓶中，依次加蒸餾水至10.0 mL，搖勻。分別加入50 mL·L-1的苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5.0 mL濃硫酸，振搖5 min，在沸水浴中靜置加熱15 min，冷卻，空白溶液作對(duì)照。在490 nm 處測(cè)定吸光度，測(cè)得結(jié)果：當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg·mL-1時(shí)，其吸光度依次為0.230 15，0.292 20，0.424 13，0.556 10，0.686 21和0.804 32。以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程：Y=0.643 8X+0.000 8(r=0.999 7)。

2.5款冬花多糖功能飲料的調(diào)制

2.5.1款冬花多糖飲料的調(diào)配以款冬花多糖為主原料，配以蔗糖、檸檬酸和β-環(huán)糊精的基礎(chǔ)液，在各成分固定的前提下，采用L934正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以飲料的口感為重要指標(biāo)，優(yōu)選飲料的基礎(chǔ)液用量、糖度和酸度。因素水平見(jiàn)表1。

表1款冬花多糖功能飲料正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment for the coltsfoot polysaccharide functional beverages preparation

水平因素A,款冬花多糖/gB,砂糖/gC,檸檬酸/g14050.2025080.24360100.28

2.5.2款冬花多糖功能飲料正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)中國(guó)食品藥品標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品口感評(píng)價(jià)方法的感官評(píng)價(jià)法，若口感具有檸檬酸味且口感舒適得分50；外觀形態(tài)清亮透明無(wú)肉眼可見(jiàn)雜質(zhì)得分25；色澤為黃綠色且均勻穩(wěn)定得分25，根據(jù)此評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果見(jiàn)表2。

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，飲料的最佳配方為A3B2C2，即款冬花多糖60 g，白砂糖8 g和檸檬酸0.24 g。

表2款冬花多糖功能飲料調(diào)配正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 The orthogonal experiment results of coltsfoot polysaccharide functional beverage formulations

實(shí)驗(yàn)號(hào)A,款冬花多糖B,砂糖C,檸檬酸評(píng)分1A1B1C1652A1B2C2723A1B3C3684A2B1C1705A2B2C2786A2B3C3757A3B1C1788A3B2C2859A3B3C380K1205225223K2223222225K3243224223R3832

表3款冬花功能飲料影響因素方差分析結(jié)果

Tab.3 Results of variance analysis

方差來(lái)源離差平方和SS自由度F值顯著性A200245.81360**B12.68222.60744*C0.003228.89818誤差0.0013272

注：F0.05(2，2)=19.0，F(xiàn)0.01(2，2)=99.0；**P<0.01，*P<0.05。

2.5.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證A3B2C2是最佳配方，與感官評(píng)價(jià)得分80的A3B3C3進(jìn)行比較，按照1∶5擴(kuò)大功能飲料實(shí)驗(yàn)量的配比，分別平均測(cè)試3次，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4工藝驗(yàn)證結(jié)果

Tab.4 Results of process validation

序號(hào)款冬花多糖/g白砂糖/g檸檬酸/g感官評(píng)分(100)A3B2C2(1)6080.2488A3B2C2(2)6080.2486A3B2C2(3)6080.2486平均6080.2486.66A3B3C3(1)60100.2879A3B3C3(2)60100.2878A3B3C3(3)60100.2879平均60100.2878.66

由表4可知，按照此工藝進(jìn)行操作，款冬花多糖功能飲料[7-9]的感官評(píng)分：A3B2C2平均得分為86.66，而A3B3C3平均得分為78.66 。結(jié)果表明，按照A3B2C2制備款冬花多糖功能飲料最為合理。

2.5.4款冬花多糖功能飲料矯味劑的篩選β-環(huán)糊精在包合時(shí)，結(jié)構(gòu)中全部或部分包入包合分子形成的包合物具有促進(jìn)藥物穩(wěn)定化、增加難溶性物質(zhì)和生物利用度、減少不良反應(yīng)和刺激性的特點(diǎn)，因此利用β-環(huán)糊精對(duì)款冬花多糖飲料的雜質(zhì)進(jìn)行包合，能夠掩蓋其不良味道，易于讓人接受。β-環(huán)糊精對(duì)雜質(zhì)包合的處理結(jié)果依次為：味道偏澀0.1%，味道偏澀0.20%，味道偏澀0.30%，味道偏澀0.40%。

2.5.5款冬花多糖功能飲料防腐劑的篩選用酸度計(jì)測(cè)量該飲料的pH值為4.6，考慮到款冬花多糖為液體制劑，為有效防腐，加入的防腐劑[10]為苯甲酸，苯甲酸未解離的分子抑菌作用強(qiáng)，故在酸性溶液中抑菌效果較好，pH值為4時(shí)最佳，此類防腐劑適用于中藥液體制劑，苯甲酸防腐劑用量為0.1%～0.25%，在該實(shí)驗(yàn)中用量為1.5 g。

2.6款冬花多糖功能飲料的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

2.6.1·DPPH試劑原理·DPPH法是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、直接、可行的測(cè)試抗氧化實(shí)驗(yàn)方法。二苯代苦味?；且环N很穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中呈紫色，在517 nm處有最大吸收峰。當(dāng)有自由基清除劑(AE)存在時(shí)，其單電子被結(jié)合而使其顏色減退，在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度減小，減小的程度與清除能力及其數(shù)量呈定量關(guān)系。因此，在517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)款冬花多糖功能飲料·DPPH自由基的清除效果[11-12]，計(jì)算其抗氧化能力。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此,可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分析。本實(shí)驗(yàn)以·DPPH清除率為指標(biāo)，研究款冬花多糖功能飲料[13]清除·DPPH的能力。

2.6.2實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)確稱取0.01 g ·DPPH溶解在無(wú)水乙醇中，用250 mL棕色量瓶定容，放入冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)樣品組和2個(gè)對(duì)照組。在2 mL ·DPPH醇溶液中加入2 mL樣品溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照組1用2 mL純凈水代替樣品溶液；對(duì)照組2用2 mL純凈水代替2 mL ·DPPH醇溶液，按照下式計(jì)算樣品對(duì)·DPPH自由基的清除率I，見(jiàn)表5。并計(jì)算出清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50：

I=1-(Ai-Aj)/A0×100%

式中：Ai為對(duì)照組1的吸光度，A0為對(duì)照組2的吸光度，Aj為樣品組的吸光度。

表5款冬花多糖功能飲料對(duì)·DPPH自由基的清除

Tab.5 The results of coltsfoot polysaccharide functional beverage clearing the ·DPPH radicals

樣品液質(zhì)量濃度/mg·mL-1AiAjA0I10.3300.0290.34512.7520.3280.0710.34525.5130.3280.0960.34532.7540.3200.1250.34543.4750.3120.1290.34546.9560.3390.1680.34550.7270.3470.1840.34553.3380.3510.1950.34554.7890.3770.2220.34555.07

3結(jié)論

款冬花多糖功能飲料制備最佳配比為：款冬花多糖60 g，砂糖8 g，檸檬酸0.24 g，β-環(huán)糊精0.2 g和苯甲酸1.5 g?？疃ǘ嗵枪δ茱嬃蠈?duì)·DPPH自由基的清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50為6 mg·mL-1。

4討論

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doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.022

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0399-04

(收稿日期：2015-10-25)

Preparation of coltsfoot polysaccharide functional beverage and determination of anti-oxidation ability

LI Gaiyan1，LIU Xiaodan1，ZHANG Linna2

(1.Shaanxi Shuntian Pharmaceutical Limited Company，Xi′an 710077，China；2.Shaanxi Xinminsheng Pharmaceutical Limited Company，Xi′an 710026，China)

Abstract:Objective To investigate the optimal preparation conditions of the functional beverage of coltsfoot polysaccharide，and to evaluate the antioxidant capacity.Methods An orthogonal design method was adopted for the functional beverage preparation process，and the oxidation resistance effect was studied by ·DPPH reagent.Results The optimal ratio of the preparation was 60 g coltsfoot polysaccharide，sugar 8 g，citric acid 0.24 g and β-cyclodextrin 0.2 g.Conclusion A suitable preparation process for coltsfoot polysaccharide functional beverages was established,and the polysaccharide functional beverages has significant antioxidant activity.Key words： coltsfoot；polysaccharide；functional beverages；·DPPH antioxidant activity