姚靜靜，胡驍飛，韓俊嶺，李青梅，王方雨，鄧瑞廣，張改平，3*

?

伏馬菌素B1單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法初步應(yīng)用

姚靜靜1，胡驍飛1，韓俊嶺2，李青梅1，王方雨1，鄧瑞廣1，張改平1，3*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453100；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州450002）

摘 要：擬制備靈敏高、特異性強(qiáng)的抗伏馬菌素B1（FB1）單克隆抗體，并初步應(yīng)用于FB1的檢測(cè)，以期為FB1的免疫學(xué)快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。采用碳二亞胺法（EDC）制備人工抗原FB1－BSA和FB1－OVA。以免疫原FB1－BSA免疫BALB/c小鼠，每四周免疫一次。四免后，小鼠脾B細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，采用ELISA篩選，建立分泌抗FB1抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；采用動(dòng)物體內(nèi)誘生腹水方法制備出抗FB1單抗，并鑒定單抗的各種性能；初步建立FB1免疫學(xué)檢測(cè)方法。結(jié)果得到1株穩(wěn)定分泌抗FB1單抗的雜交瘤細(xì)胞株2E11－H3，該細(xì)胞株分泌的mAbs的效價(jià)高達(dá)1∶1.02×106，親和力常數(shù)平均值為7.98×1010L·mol－1，亞型為IgG3。FB1mAbs的工作濃度為1∶6.0×104，與FB1發(fā)生特異性反應(yīng)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得IC50＝43.65ng·mL－1；與FB1結(jié)構(gòu)類(lèi)似物FB2和FB3的交叉反應(yīng)率分別為385%和72.4%，與其他霉菌毒素及載體蛋白BSA和OVA均無(wú)交叉反應(yīng)。樣品回收率在85.85%～114.07%，平均值為98.81%；變異系數(shù)為10.11%。本研究制備出了靈敏度高、特異性強(qiáng)、親和力高的FB1單抗，并初步建立FB1免疫學(xué)檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：伏馬菌素B1；單克隆抗體；雜交瘤；ELISA

伏馬菌素（fumonisin）主要是由串珠鐮刀菌屬產(chǎn)生的一類(lèi)有毒害和致癌性的真菌毒素，包括FB1、FB2、FB3等11種（結(jié)構(gòu)如圖1），其中伏馬菌素B1（FB1）是主要組分，也是毒性最強(qiáng)的組分，主要污染玉米、小麥、稻米等糧食作物及其制品［1－3］。采食含有FB1的飼料和食品，可導(dǎo)致人及動(dòng)物中毒，如馬的腦白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫癥、大鼠肝癌、人類(lèi)食管癌和肝癌等［4－7］。國(guó)際癌癥研究中心（IARC）將FB1列為2B類(lèi)致癌物質(zhì)（即人類(lèi)可能致癌物）［8］，并對(duì)其在飼料及食品中含量做了限量（1～3mg·kg－1）規(guī)定［9］。

目前，檢測(cè)FB1的方法主要有儀器分析（高效液相色譜法、質(zhì)譜及液相色譜－質(zhì)譜）［1011］和免疫學(xué)檢測(cè)方法［12－13］。儀器分析檢測(cè)方法盡管靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但儀器昂貴，檢測(cè)成本比較高，且不能用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)方法具有樣品處理簡(jiǎn)單、靈明度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)大量樣品，已成功運(yùn)用于食品和飼料中霉菌毒素的檢測(cè)［15，19－22］。2004年，江濤等制備出FB1單克隆抗體，IC50＝138.95ng·mL－1［14］；以此單克隆抗體研制的試劑盒，抑制曲線回歸線方程：y＝－0.582 0 x＋1.793 0，R2＝0.990 1，IC50＝166.59 ng·mL－1［15］。2007至2012年間，學(xué)者們先后制備出IC50為90.88、3.89和1.43μg·mL－1的FB1mAbs［16－18］。受抗體靈敏度的限制，以上 FB1mAbs，制備快速檢測(cè)試紙時(shí)，不能滿(mǎn)足檢測(cè)限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要制備出更高靈敏度的FB1mAbs，以便建立更為靈敏的FB1檢測(cè)方法，并為FB1快速檢測(cè)試紙的制備奠定基礎(chǔ)。

圖1 伏馬菌素B1、B2、B3的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3

本研究以FB1－BSA為免疫原，結(jié)合雜交瘤技術(shù)和ELISA檢測(cè)制備出針對(duì)伏馬菌素B1的高親和力、靈敏度和特異性的單克隆抗體，并初步建立了FB1免疫學(xué)檢測(cè)方法。該單克隆抗體結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，有望建立靈敏度更高的免疫學(xué)快速檢測(cè)伏馬菌素的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

伏馬菌素B1、B2、B3（FB1、FB2、FB3），黃曲霉毒素B1和M1（AFB1、AFM1），T－2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），赭曲霉毒素（OTA）牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA），1640培養(yǎng)基、HAT、HT、PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、羊抗鼠酶標(biāo)二抗（GAM－IgGHRP）、抗體亞類(lèi)測(cè)定試劑盒購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清（Gibico公司）。Bio－Rad－550型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio－Rad公司；CO2培養(yǎng)箱（Themo公司），潔凈臺(tái)，生物倒置顯微鏡（Leica公司），U－3000紫外掃描儀（UV），日本島津；3K－18高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；DK－8D電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司，HPLC－MS購(gòu)自Waters公司；BALB/c小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SP2/0骨髓瘤購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。其他試劑均為分析純。

1.2 ELISA溶液體系

包被液：0.05mol·L－1、pH＝9.6碳酸鹽緩沖液（CBS）；洗液（PBST）：0.01mol·L－1、pH＝7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），含0.05%Tween－20；封閉液：5%豬血清的PBST；顯色液：TMB的磷酸－檸檬酸緩沖液；終止液：2mol·L－1硫酸溶液。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原FB1－BSA的合成 稱(chēng)取2mg伏馬菌素B1充分溶于1mL PBS，攪拌下加入1.7 mg碳二亞胺（EDC），4℃下攪拌0.5h，充分活化FB1。將3.6mg BSA溶于1mL PBS的溶液逐滴加入以上溶液中，4℃下避光反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液澄清，用PBS為透析液，每6h更換一次，透析3d。然后，將透析袋中液體5 000r·min－1離心5min，收集上清，即得免疫抗原FB1－BSA，凍存?zhèn)溆?。合成路線如圖2。制備檢測(cè)抗原FB1－OVA的方法同上。

圖2 抗原FB1－BSA的合成路線Fig.2 The synthesis of the artificial antigen FB1－BSA

1.3.2 動(dòng)物免疫 取8周齡雌性BALB/c小鼠4只，首免將免疫原FB1－BSA與弗氏佐劑乳化5 min，按20μg·200μL－1每只的劑量進(jìn)行初免，頸部、皮下多點(diǎn)注射。免疫周期為4周，免疫劑量相同，共免4次，二、三、四免均用弗氏不完全佐劑。四免后1周采血ELISA測(cè)定，選擇血清效價(jià)高與FB1抑制強(qiáng)的小鼠，融合前3d用完全抗原50μg·200 μL－1每只，不添加佐劑，加強(qiáng)免疫。

1.3.3 細(xì)胞融合 免疫脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合：融合前1d無(wú)菌條件下取BALB/c小鼠腹腔內(nèi)細(xì)胞做飼養(yǎng)細(xì)胞，鋪96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板備用；取加強(qiáng)免疫過(guò)的小鼠眼睛血，作陽(yáng)性對(duì)照，將小鼠脫頸致死，無(wú)菌條件下取脾制備脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按照10∶1的比例混合，用50%PEG－1500促融；將融合后的細(xì)胞懸液接種到已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，先用HAT，再用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)，10d后用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.4 雜交瘤篩選及抗體檢測(cè) 間接非競(jìng)爭(zhēng)與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行篩選。以FB1－OVA為包被原，以SP2/0細(xì)胞上清為空白對(duì)照，間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選分泌FB1抗體的細(xì)胞孔，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA確認(rèn)并檢測(cè)敏感性。選擇陽(yáng)性較高、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋克隆化，之后擴(kuò)大培養(yǎng)、液氮凍存。

1.3.5 抗FB1mAbs的大量制備 采用動(dòng)物體內(nèi)誘生腹水法制備FB1單抗：向8周左右BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5mL·只－1，10d后腹腔注射單克隆陽(yáng)性細(xì)胞0.5mL·只－1（0.5～1× 106個(gè)），8～10d后抽取腹水，離心除去油脂沉淀后，即得FB1mAbs。

1.3.6 單克隆抗體的鑒定

1.3.6.1 單克隆抗體的純化：采用辛酸－硫酸銨法［23］純化mAbs蛋白。10%SDS－PAGE檢測(cè)蛋白的純度并估算蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.6.2 抗體亞類(lèi)的測(cè)定：采用抗體亞類(lèi)試劑盒測(cè)定。

1.3.6.3 抗體效價(jià)：采用間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)：以4μg·mL－1的包被原FB1－OVA包板；將mAbs稀釋至1∶1 000，倍比稀釋?zhuān)?7℃放置15 min，加入5%豬血清的PBST稀釋1 000倍的GAM－IgG－HRP，37℃酶標(biāo)30min，加入TMB底物顯色8min，加入終止液（2mol·L－1H2SO4）10 min內(nèi)測(cè)吸光值OD450nm。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（PC，陽(yáng)性小鼠血清），陰性對(duì)照（NC，SP2/0細(xì)胞上清液），空白對(duì)照（BC，抗體稀釋液）各兩孔，檢測(cè)結(jié)果以（OD實(shí)驗(yàn)－OD空白）/（OD陰性－OD空白）≥2.1為陽(yáng)性。

1.3.6.4 抗體親和力測(cè)定：采用間接ELISA測(cè)定單克隆抗體的親和力常數(shù)［24］：分別以1和2μg·mL－1的抗原FB1－BSA包板，每孔50μL，37℃溫育2h后，PBST洗板；用5%豬血清的PBST封閉，每孔220μL，37℃溫育1h，PBST洗板；將mAbs稀釋至1∶10 000（7.2μg·mL－1），倍比稀釋測(cè)OD450nm，方法參見(jiàn)“1.3.6.3”。親和力常數(shù)的計(jì)算方法：以抗體稀釋倍數(shù)－OD450nm值作圖，計(jì)算不同抗原濃度時(shí)OD450nm對(duì)應(yīng)的抗體濃度，代入公式K＝（n－1）/2 （nAb′－Ab）計(jì)算親和力常數(shù)kaff（L·mol－1）。Ab 和Ab′分別表示當(dāng)抗原濃度為Ag和Ag′時(shí)，OD450nm對(duì)應(yīng)的抗體濃度（mol·L－1），n＝Ag/Ag′。

1.3.6.5 靈敏度：通常以50%抗原抗體結(jié)合抑制藥物的濃度（IC50）表示。采用棋盤(pán)法，選擇OD值在1.0左右時(shí)包被原濃度為最佳工作濃度。靈敏度取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和零濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)（B0）變異的大小：斜率的絕對(duì)值越大，B0的變異越小，則靈敏度越高。零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值代表100%的活性（B0），B/B0為藥物的抑制率，即抑制率＝系列藥物組OD值/B0。以FB1濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)，制作mAbs的抑制曲線，可得出IC50。

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)步驟如下：（1）以包被原最佳工作濃度包板，每孔50μL，37℃溫育2h后，PBST洗板；（2）用5%豬血清的PBST封閉，每孔220μL，37℃溫育1h，洗板；（3）FB1濃度設(shè)置為0、10、20、40、80、160、320ng·mL－1，每孔50μL，加入50μL抗FB1抗體，稀釋液為PBS，設(shè)置陰性對(duì)照（NC）和空白對(duì)照（BC），37℃溫育15min后洗板；（4）加入5%豬血清的PBST稀釋1 000倍稀釋的GAM－IgG－HRP，每孔50μL；（5）加酶底物TMB顯色液，每孔50μL，室溫反應(yīng)10min；（6）終止顯色反應(yīng)，加入終止液2mol·L－1H2SO4，每孔50 μL，用酶標(biāo)儀讀OD450nm值。

1.3.6.6 抗FB1mAbs特異性：采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，藥物有伏馬菌素B2和B3（FB2、FB3），黃曲霉毒素B1和M1（AFB1、AFM1），T－2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），赭曲霉毒素（OTA）等真菌類(lèi)毒素及載體蛋白BSA 和OVA，方法同“1.3.6.5”。

1.3.6.7 回收率的測(cè)定：用“1.3.6.5”中建立的抑制曲線，測(cè)定含有FB180ng·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液20次，計(jì)算測(cè)定值、回收率和變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）?；厥章剩剑ㄐ聵悠窚y(cè)定值－原樣品測(cè)定值）/已知加標(biāo)量×100%。

1.3.6.8 液相色譜－質(zhì)譜串聯(lián)（HPLC－MS）法驗(yàn)證：由河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供的2個(gè)霉變玉米樣品，經(jīng)粉碎處理，分別采用HPLC－MS和本研究建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品每種方法測(cè)6次。檢測(cè)結(jié)果以±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素獨(dú)立t檢驗(yàn)分析，P＜0.05說(shuō)明差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 融合小鼠的選擇

采用人工免疫抗原FB1－BSA免疫BALB/c小鼠，四免后一周，采免疫鼠血清。包被原FB1－OVA的工作濃度為4μg·mL－1，將編號(hào)為1～4小鼠的血清分別按照1∶200的比例用PBS稀釋?zhuān)捎瞄g接ELISA測(cè)效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1，說(shuō)明四只小鼠均產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，血清效價(jià)高達(dá)1∶12 800。接著，將以上編號(hào)為1～4小鼠的血清分別按照1∶200、1∶200、1∶800、1∶400稀釋?zhuān)捎瞄g接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)小鼠血清的敏感性，結(jié)果見(jiàn)表2。FB1標(biāo)品對(duì)四只小鼠血清均產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制，選擇抑制效果最好的3號(hào)鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

表1 間接ELISA測(cè)多抗血清效價(jià)Table 1 Titer of antiserum detected by indirect ELISA

表2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)多抗血清抑制效價(jià)Table 2 Inhibitive titer of antiserum against FB1by indirect competitive ELISA

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

細(xì)胞融合后7d，10塊細(xì)胞培養(yǎng)板上960孔均形成雜交瘤細(xì)胞株，融合率達(dá)100%。間接ELISA檢測(cè)均為陽(yáng)性孔，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)以上OD值較高的136陽(yáng)性孔中有46孔為假陽(yáng)性，其中2E11、4A9、6F8和7B11這四孔的細(xì)胞上清的效價(jià)較高且抑制效果較好，經(jīng)過(guò)一次亞克隆后獲得1株雜交瘤細(xì)胞（2E11－H3），經(jīng)傳代一個(gè)月，凍存與復(fù)蘇后，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。

2.3 抗體的純度及其特性鑒定

2.3.1 抗體純度的鑒定 經(jīng)過(guò)辛酸－硫酸銨純化前與純化后的mAbs蛋白的10%SDS－PAGE電泳圖見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，純化后的抗FB1單克隆抗體蛋白具有較高的純度，該蛋白的兩條鏈分別約為50 和25ku，經(jīng)Bio－Rad Qunitity ONE分析估算出該抗體的相對(duì)分子質(zhì)量約為150ku。

2.3.2 抗體亞類(lèi)的鑒定 2E11－H3雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)過(guò)抗體亞類(lèi)試劑盒測(cè)定，鑒定其為IgG3。

2.3.3 抗體效價(jià) 抗FB1單克隆抗體的大量制備參見(jiàn)方法“1.3.5”。雜交瘤細(xì)胞株2E11－H3的細(xì)胞上清和純化后的mAbs采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定效價(jià)。細(xì)胞上清效價(jià)達(dá)1∶100以上，純化后的mAbs效價(jià)高達(dá)1.02×106，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 間接ELISA測(cè)純化后抗FB1mAbs效價(jià)Table 3 Titer of purified mAbs against FB1detected by indirect ELISA

2.3.4 抗體親和力測(cè)定 方法見(jiàn)“1.3.6.4”，得到系列OD450nm值見(jiàn)圖4，代入公式，得到該mAbs的親和力常數(shù)平均值為7.98×1010L·mol－1。

2.3.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立 采用ELISA方陣確定包被原FB1－OVA的最佳工作濃度為2.6μg·mL－1，抗FB1單抗的稀釋倍數(shù)為1∶60 000，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG的濃度為1 000倍稀釋?zhuān)贵w與抗原反應(yīng)時(shí)間為15min，酶標(biāo)時(shí)間為30min，TMB底物反應(yīng)時(shí)間為8min，標(biāo)準(zhǔn)品FB1的濃度范圍為0、10、20、40、80、160、320ng·mL－1，結(jié)果見(jiàn)表4，說(shuō)明FB1標(biāo)品對(duì)抗FB1單抗具有較高的抑制水平。

圖3 抗FB1單克隆抗體的SDS－PAGEFig.3 SDS－PAGE for mAbs against FB1

圖4 抗體親和力測(cè)定曲線Fig.4 Affinity curve for mAbs against FB1

表4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)抗FB1單克隆抗體抑制水平Table 4 Inhibitive titer of mAbs against FB1detected by indirect competitive ELISA

2.3.6 抗體靈敏度與特異性 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗FB1單克隆抗體對(duì)伏馬菌素B1的抑制。由表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)按照“1.3.6.5”的方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為5～320ng·mL－1，回歸線方程：y＝－0.478 3x＋1.285 8（R2＝0.990 1），IC50＝43.65ng·mL－1，檢出限為3.96ng·mL－1，完全抑制時(shí)的濃度為149.78ng·mL－1，說(shuō)明以上制備的抗FB1mAbs 對(duì)FB1具有較高的靈敏度。該mAbs與伏馬菌素B2和B3（FB2、FB3），黃曲霉毒素B1和M1（AFB1、AFM1），T－2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），赭曲霉毒素（OTA）等真菌類(lèi)毒素及載體蛋白BSA和OVA的交叉反應(yīng)的測(cè)定方法參見(jiàn)“1.3.6.6”，結(jié)果見(jiàn)表5，說(shuō)明該抗體與FB1的親和力很強(qiáng)，具有較高的特異性。同時(shí)，可用于檢測(cè)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物FB2、FB3。

2.3.7 回收率的測(cè)定 為了評(píng)估本研究建立的對(duì)FB1的免疫學(xué)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)回收率及變異系數(shù)進(jìn)行測(cè)定，方法參見(jiàn)“1.3.6.7”，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明：測(cè)定80ng·mL－1FB1的標(biāo)準(zhǔn)液20次，測(cè)定值在68.68～91.25ng·mL－1，平均值為79.05ng·mL－1；回收率在85.85%～114.07%，平均值為98.81%；變異系數(shù)為10.11%。說(shuō)明已建立的檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確性。

表5 抗FB1單克隆抗體與其他競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)Table 5 The cross reaction of mAbs against FB1with other analogues

2.3.8 與HPLC－MS檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比 采用本研究建立的FB1檢測(cè)方法與HPLC－MS法分別對(duì)2個(gè)霉變的玉米樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。將兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素獨(dú)立t檢驗(yàn)分析，P＞0.05說(shuō)明差異不顯著。說(shuō)明該ELISA對(duì)FB1的測(cè)定結(jié)果具有較高可靠性。

圖5 抗FB1單克隆抗體的抑制曲線Fig.5 The inhibitive curve for mAbs against FB1

表6 回收率測(cè)定結(jié)果Table 6 The results of recovery

表7 本檢測(cè)方法與HPLC－MS測(cè)定結(jié)果對(duì)比（±s）Table 7 The comparation of the ELISA with HPLC－MS（±s）　μg·g－1

表7 本檢測(cè)方法與HPLC－MS測(cè)定結(jié)果對(duì)比（±s）Table 7 The comparation of the ELISA with HPLC－MS（±s）　μg·g－1

每種方法測(cè)6次The assays were carried out in six replicates on the same time

樣品編號(hào)Sample No.ELISA測(cè)定值Test of ELISA HPLC－MS測(cè)定值Test of HPLC－MS 1 　1.86±0.21 　1.71±0.12 2 　1.17±0.26 　1.06±0.15

3 討 論

伏馬菌素B1作為一種相對(duì)分子質(zhì)量只有722.8的小分子真菌毒素，獲得該毒素的抗體，合成FB1的人工抗原就顯得尤為重要。FB1的分子結(jié)構(gòu)式（圖1）含有4個(gè)羧基，1個(gè)氨基和3個(gè)羥基，可采用EDC法［13，18］或戊二醛法［14－17，21］直接與載體蛋白BSA、OVA偶聯(lián)，制備免疫原FB1－BSA和包被原FB1－OVA。鑒于戊二醛法是通過(guò)醛基與氨基形成亞胺鍵的偶聯(lián)，而亞胺鍵在水溶液會(huì)發(fā)生水解，導(dǎo)致FB1從載體蛋白上脫離；同時(shí)，由于FB1分子中的氨基活性遠(yuǎn)高于載體蛋白中的氨基，極易發(fā)生FB1的自聯(lián)。本研究采用EDC法，采取FB1、EDC、BSA （OVA）的物質(zhì)的量之比為1∶3.3∶1/50進(jìn)行偶聯(lián)，以盡量避免FB1的自聯(lián)，獲得人工抗原FB1－BSA和包被原FB1－OVA，得到高特異性和親和力的單克隆抗體證實(shí)了人工抗原合成上的成功。

關(guān)于該抗體的靈敏度，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗FB1單克隆抗體的抑制效價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線方程為：y＝－0.478 3x＋1.285 8（R2＝0.990 1），IC50＝43.65ng·mL－1，檢出限為3.96ng·mL－1，完全抑制時(shí)的濃度為149.78ng·mL－1。相比于早期報(bào)道的抗FB1單克隆抗體［14－18］而言，該抗體具有更高的靈敏度，結(jié)合膠體金層析技術(shù)，有望建立靈敏度更高的免疫學(xué)快速檢測(cè)FB1的方法，更方便、快捷地檢測(cè)玉米及其制品中伏馬菌素的含量。

對(duì)抗體特異性的檢測(cè)，本研究選擇了幾種常見(jiàn)的污染谷物的真菌毒素及伏馬菌素B2、B3與抗FB1mAbs進(jìn)行交叉反應(yīng)，其中與其他種類(lèi)的真菌毒素的交叉反應(yīng)率均＜0.44%，不干擾FB1的檢測(cè)。與FB2、FB3的交叉反應(yīng)率分別為385%和72.4%，可能由于伏馬菌素是一類(lèi)長(zhǎng)鏈狀的小分子，與FB1相比，F(xiàn)B2、FB3在結(jié)構(gòu)上少了一個(gè)羥基（－OH）（圖1），這樣的微小差別對(duì)分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響較小，相應(yīng)的動(dòng)物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的差別會(huì)較小。這是該抗FB1單克隆抗體與FB2、FB3交叉反應(yīng)率較高的原因?？紤]到FB1是伏馬菌素的主要成分，也是毒性最強(qiáng)的組分，以上交叉反應(yīng)的存在并不影響該單克隆抗體在檢測(cè)FB1中的使用，同時(shí)可用于檢測(cè)FB1、FB2、FB3的累計(jì)含量。

基于該單克隆抗體建立的FB1ELISA檢測(cè)方法，樣品回收率在85.85%～114.07%，平均值為98.81%；變異系數(shù)為10.11%，與HPLC－MS的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié) 論

作者通過(guò)合成人工抗原，免疫小鼠，細(xì)胞融合及篩選，成功獲得能夠穩(wěn)定分泌抗FB1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并制備靈敏度較高（IC50＝43.65 ng·mL－1），親和力和特異性均較好的抗FB1mAbs。基于該單克隆抗體建立的FB1ELISA檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。希望該抗體可以結(jié)合膠體金免疫層析技術(shù)，建立靈敏度更高的快速檢測(cè)FB1的方法。

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（編輯 白永平）

Development and Preliminary Application of the Monoclonal Antibody against Fumonisin B1

YAO Jing－jing1，HU Xiao－fei1，HAN Jun－ling2，LI Qing－mei1，WANG Fang－yu1，DENG Rui－guang1，ZHANG Gai－ping1，3*
（1.Henan Academy of Agriculture Science/Key Laboratory of Animal Immunology，Ministry of Agriculture/Henan Key Laboratory of Animal Immunology，Zhengzhou450002，China；2.The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang453100，China；3.Henan Agricultural University，Zhengzhou450002，China）

Abstract：A monoclonal antibody against fumonisin B1（FB1）was developed and applied to establish rapid immunology detection method of FB1.FB1was successfully conjugated with BSA and OVA using EDC，respectively.Hybridoma cell line secreting monoclona antibodys（mAbs）against FB1was produced by fusing murine SP2/0cells with the spleen B cells of BALB/c mice which was immunized with FB1－BSA for four times，every four weeks at a time.The mAbs against FB1were obtained by inducing ascites in the mice body.The affinity，titer，substype and sensibility of the mAbs were assayed with ELISA.Furthermore，the mAbs were preliminarily applied in immunology detection of FB1.The mAbs against FB1whose substype was tested as IgG3were secreted byhybridoma cell line（2E11－H3）.The working concentration of the mAbs was 1∶6.0×104，affinity constant was 7.98×1010L·mol－1，IC50was 43.65ng·mL－1.The cross reaction ratios with Fumonisin B2and B3were accordingly 385%and 72.4%，while none with other analogues and carrier protein.The recovery rate of sample was among 85.85%－114.07%，the average was 98.81%and the coefficient of variation was 10.11%.The monoclonal antibody against FB1with high affinity，specificity and sensibility was produced and preliminarily applied in immunology determination of FB1.

Key words：fumonisin B1；monoclonal antibody；hybridomas；ELISA

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－1009－09

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.019

收稿日期：2015－10－22

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2014BAD13B05）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（2013YQ29）；河南省基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目（162300410135）

作者簡(jiǎn)介：姚靜靜（1988－），女，河南禹州人，助理研究員，碩士，主要從事食品安全檢測(cè)研究，E－mail：yaojinglucky8023@163.com

*通信作者：張改平（1960－），男，河南內(nèi)黃人，中國(guó)工程院院士，E－mail：zhanggaiping2003@163.com