孫 浩，王子帥，徐銀學(xué)*，唐中林*

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H19基因的單核苷酸多態(tài)性與豬生長性狀的相關(guān)分析及其時空表達(dá)

孫 浩1，王子帥2，徐銀學(xué)1*，唐中林2*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

摘 要：本試驗為了了解H19基因在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的作用，首先采用實(shí)時熒光定量PCR的技術(shù)檢測了H19的組織分布以及在骨骼肌生長發(fā)育中的動態(tài)表達(dá)。然后通過混合池測序檢測了H19外顯子和內(nèi)含子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（SNP），利用質(zhì)譜在大白豬群體中進(jìn)行SNPs位點(diǎn)基因型鑒定，并進(jìn)行標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析。H19基因在大白豬的心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、腿肌、背肌中均有表達(dá)，且在骨骼?。ㄍ燃　⒈臣。┖湍I中高表達(dá)。在骨骼肌發(fā)育中，H19主要是在胚胎期和出生后40d之前有較高表達(dá)量，并且在胚胎期105d達(dá)到最大值。對7個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，RS15位點(diǎn)與達(dá)100kg體重的校正日齡顯著相關(guān)（P＝0.046 2＜0.05），RS20位點(diǎn)與100kg的校正眼肌面積顯著相關(guān)（P＝0.009 5＜0.01）。RS15與RS16緊密連鎖，其單倍型與校正背膘厚顯著相關(guān)（P＝0.049 8＜0.05）；RS17與RS18單倍型與達(dá)100kg的校正眼肌面積顯著相關(guān)（P＝0.037 1＜0.05）。結(jié)果表明H19基因參與豬骨骼肌發(fā)育調(diào)控，是豬產(chǎn)肉性狀的候選基因。

關(guān)鍵詞：豬；長鏈非編碼RNA；H19；骨骼??；生長性狀

中國是養(yǎng)豬大國，豬肉是人們?nèi)粘Ｉ钪腥忸愂称返闹饕獊碓?。隨著消費(fèi)者對豬肉品質(zhì)、風(fēng)味的要求日益提高，相關(guān)優(yōu)良產(chǎn)肉性狀的豬種選育逐漸成為豬生產(chǎn)工作中的重點(diǎn)之一。而豬肉的品質(zhì)、風(fēng)味亦取決于豬骨骼肌的生長和脂肪的沉積。骨骼肌是組成酮體瘦肉的主要成分，進(jìn)而是豬產(chǎn)肉性狀的決定因素。豬產(chǎn)肉性狀是微效多基因控制的，對豬產(chǎn)肉性狀的相關(guān)基因研究中，最重要的兩個基因是調(diào)節(jié)骨骼肌纖維跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2＋的魚尼丁受體HAL/RYR1［1］和影響肌肉糖原含量的RN基因［2］。長鏈非編碼RNAs（Long non－coding RNAs，LncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄后不翻譯成蛋白、僅編碼長RNA序列的基因。近年來研究表明，在骨骼肌生長發(fā)育過程中，lncRNA同樣發(fā)揮了重要作用。H19基因是依賴于RNA聚合酶II的胞質(zhì)lncRNA，是首批發(fā)現(xiàn)的lncRNAs之一，通過轉(zhuǎn)錄高水平、大約2.5 kb的轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮功能［3－4］。轉(zhuǎn)錄本只有一個短的ORF，在物種間保守性低［5］。H19基因第一內(nèi)含子內(nèi)部可以轉(zhuǎn)錄miR－675的序列［6］。H19的第一內(nèi)含子編碼miR－675－3p和miR－675－5p，一方面，壓力反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白HuR可以通過調(diào)控miR－675的表達(dá)，繼而影響其下游IGF1R的功能［7］；另一方面，這些miRNA與靶基因Smad1、Smad5、Cdc6結(jié)合，進(jìn)而對骨骼肌發(fā)育分化和再生產(chǎn)生影響。H19基因在人和小鼠的成年肌肉中表達(dá)量很高［89］，并且在肌纖維分化和肌肉再生時它的表達(dá)都顯著上調(diào)；另外，H19還可以通過募集吸附let－7，影響Hmga2和Igfbp2的功能，進(jìn)而對肌纖維多核的形成產(chǎn)生影響［10］。提示H19在肌肉的生長發(fā)育中起著重要作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，對QTLs的定位并進(jìn)行分子標(biāo)記是一種行之有效的重要育種手段。例如：Z.L.Tang等［11］通過鑒定CNN3基因的SNP位點(diǎn)初步確定了該基因與仔豬斷奶重、出生重等生長性狀有關(guān)。

本研究通過對H19基因在組織和骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá)水平檢測及性狀關(guān)聯(lián)分析，提示H19可能是豬骨骼肌生長發(fā)育過程中重要的調(diào)控基因，可作為產(chǎn)肉性狀的一個候選標(biāo)記基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 組織樣品取自北京市順義區(qū)某豬場的15頭大白豬，分別于妊娠的8個時期和仔豬出生后的7個時期屠宰，采集背最長肌，分別表示為胚胎期（E33、E60、E65、E70、E75、E80、E95、E105）和出生后（D0、D20、D40、D60、D100、D140、D160）。另外采集3頭成年母豬（160d）的心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、腿肌、背肌等組織。每個階段及組織至少采集3份重復(fù)樣品。采集后立即投入液氮中保存各個組織樣品，少量于－80℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆?。隨機(jī)選取297個生長育肥的大白豬，進(jìn)行血液樣品采集。采集過程采用一次性抗凝管，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 2×Taq Master Mix購自北京康為生物技術(shù)公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，血液DNA裂解液、苯酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、70%乙醇、Trizol reagent購自Invitrogen；動物組織總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；熒光定量試劑盒購自寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 取黃豆粒大小的各個組織樣品于液氮中研磨，RNA提取按照動物組織總RNA提取試劑盒進(jìn)行操作，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的完整性，并用分光光度計檢測RNA的純度和濃度。－80℃保存?zhèn)溆?。cDNA第一鏈的合成按照RevertAidFirst StrandcDNA Synthesis Kit試劑盒步驟進(jìn)行，取1μg RNA做模板，加入1μL隨機(jī)引物Random Primer，用雙蒸水補(bǔ)齊至12μL，在PCR儀中65℃5min后取出置于冰上，向其中分別加入5×Reaction Buffer 4 μL、RiboLockTM RNase Inhibitor（20U·μL－1）1 μL、10mmol·L－1dNTP Mix 2μL和RevertAidTM M－MULV Reverse Transcriptase（200 U·μL－1）1μL，PCR反應(yīng)條件：25℃10min，42℃ 60min，70℃5min。反應(yīng)產(chǎn)物放于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 H19定量引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中豬H19基因序列（AY044827.1），利用Primer 5跨外顯子設(shè)計合成H19定量引物。根據(jù)內(nèi)參照基因GAPDHmRNA序列（NM＿001206359.1），設(shè)計定量引物，引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（表1）。

表1 H19基因定量引物Table 1 The primers for qRT－PCR of H19

1.2.3 H19基因組織和時空表達(dá)譜定量分析將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋到同一濃度，按照實(shí)時定量方法的操作說明，以GAPDH為內(nèi)參，檢驗H19基因在9個組織（心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、腿肌、背?。┖?5個時期（胚胎期（E33、E60、E65、E70、E75、E80、E95、E105）和出生后（D0、D20、D40、D60、D100、D140、D160））中的表達(dá)情況，每個樣本做3次平行試驗。反應(yīng)體系：TaqMan?Real－Time PCR Master Mixes 10μL，上下游引物各1 μL，模板2μL，雙蒸水補(bǔ)齊至20μL。反應(yīng)條件：StageⅠ：95℃30s；StageⅡ：95℃30s，60℃34 s，40個循環(huán)；StageⅢ：95℃15s，60℃1min， 95℃15s。

1.2.4 DNA混合池的構(gòu)建 利用酚氯仿法抽提32個大白豬血液DNA，在分光光度計上測量純度和濃度并在1%瓊脂糖凝膠中驗證DNA完整性后，按每一血液樣本抽取1μg的標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建DNA混合池，混勻后置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 部分H19基因序列的擴(kuò)增引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中豬H19基因序列（AY044827.1），利用Primer 5設(shè)計合成4對特異引物（表2），用來擴(kuò)增基因DNA序列中的33 946～37 298bp區(qū)域，該區(qū)域包括6個外顯子和5個內(nèi)含子。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表2 部分H19基因序列擴(kuò)增引物Table 2 Primers used to amplify partial sequence of H19gene

1.2.6 部分H19基因序列的擴(kuò)增及SNP位點(diǎn)篩選 以混合DNA池為模板加入2μL，上下游引物（表2）各1μL，2×Taq Master Mix 10μL雙蒸水補(bǔ)齊至20μL。PCR條件：95℃5min；95℃變性32s，59℃退火30s，72℃延伸1min 35s，32個循環(huán)；最后72℃10min。PCR產(chǎn)物膠回收純化后，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序，測序結(jié)果用DNAStar軟件的SeqMan中的SNP功能查找潛在的SNP位點(diǎn)，并進(jìn)行人工確定。

1.2.7 SNP位點(diǎn)在大白豬群體中的遺傳分析和標(biāo)記性關(guān)聯(lián)分析 對生長相關(guān)性狀測定時，首先對待測豬進(jìn)行24h空腹處理，在記錄待測豬的個體號、性別、測定日期、測定人員等信息后，將待測豬置于電子稱上稱重，待示數(shù)穩(wěn)定后記錄讀數(shù)。然后利用B型超聲波測定儀，掃描測定倒數(shù)第3～4肋間處且距背中線左側(cè)約5cm的背膘厚同時測定眼肌面積。將記錄數(shù)據(jù)根據(jù)以下公式進(jìn)行校正，即可獲得3個產(chǎn)肉性狀的校正值。公式：

100kg體重時校正日齡＝測定日齡－［（實(shí)測體重－100）/CF］

100kg體重時校正背膘厚＝實(shí)測背膘厚×CF

100kg體重時校正眼肌面積＝實(shí)測眼肌面積×CF

其中，CF為各性狀的校正因子。

隨機(jī)選取297個大白豬的DNA樣品，將SNP的相關(guān)信息交給北京康普森生物有限公司進(jìn)行核酸質(zhì)譜測序。對得到的基因型信息，運(yùn)用Haploview、SNPStats等軟件進(jìn)行基因型頻率（Genotype frequency）、等位基因頻率（Allele frequency）、Hardy－Weinberg平衡檢驗、遺傳純合度（Gene homozygosity，Ho）、雜合度（Heterozygosity，He）、最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、多態(tài)信息含量（Polymorphism information contenet，PIC）、單體型（Haplotype）的統(tǒng)計。運(yùn)用GraphPad和R語言軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并做PCA分析和相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 H19基因在大白豬骨骼肌不同發(fā)育階段的表達(dá)譜

以GAPDH作為內(nèi)參，通過使用real－time PCR分析H19基因在大白豬的不同發(fā)育階段（胚胎期（E33、E60、E65、E70、E75、E80、E95、E105）和出生后（D0、D20、D40、D60、D100、D140、D160））的相對表達(dá)量，其中以出生后160d（D160）的Ct為基準(zhǔn)，根據(jù)2－△△Ct公式計算。結(jié)果顯示，在骨骼肌整個發(fā)育期只有在出生后40d（D40）之前檢測出H19的表達(dá)（圖1），主要集中于骨骼肌生長發(fā)育的胚胎期和仔豬初生時期。在胚胎期105d（E105）達(dá)到峰值，且極顯著高于其他各個時期（P＜0.01），而在出生40d之后直至成年背肌中幾乎不表達(dá)，在其他時期表達(dá)量呈低度波狀表達(dá)趨勢。

圖1 H19在大白豬骨骼肌不同發(fā)育階段的相對表達(dá)Fig.1 The relative expression of H19at different development stages of Large White pigs

2.2 H19在大白豬不同組織中的表達(dá)譜

以GAPDH作為內(nèi)參，通過使用qRT－PCR檢測H19在160d大白豬的不同組織（心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、腿肌、背肌）中的相對表達(dá)量，其中以心的Ct值為基準(zhǔn)，根據(jù)2－△△Ct公式計算。結(jié)果顯示，H19在所有組織中均有表達(dá)，且在骨骼?。ㄍ燃　⒈臣。┖孔钬S富，其次在腎中含量較高（P＝0.184＞0.05），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織（P＝0.002＜0.01）；而心組織中H19表達(dá)量最低。H19在其他組織（肺、胃、肝、脾、小腸）中表達(dá)豐度居中（圖2）。

2.3 骨骼肌相關(guān)生長性狀的統(tǒng)計分析

在大白豬中，校正背膘厚在不同性別中差異不顯著（P＝0.681 0＞0.05）（表3）；而達(dá)100kg時的校正日齡（Corrected age of animals with body weight of 100kg，CA100）在不同性別中差異極顯著（P＜0.01），且公豬生長比母豬快了9.29d；達(dá)100kg時的校正眼肌面積（Corrected eye muscle area of animals with body weight of 100kg，CEMA100）在不同性別中差異顯著（P＝0.036 4＜0.05），母豬比公豬大了1.59cm2（表3）。

圖2 H19在大白豬不同組織中的相對表達(dá)量Fig.2 The relative expression of H19in different tissues of Large White pigs

表3 性別對大白豬校正背膘厚、達(dá)100kg校正眼肌面積和校正日齡的影響Table 3 The impact of sex on the corrected backfat，CA100and CEMA100in Large White pigs

2.4 基因型及基因統(tǒng)計分析和遺傳多樣性分析

通過混合池測序和人工篩選，確定7個潛在的SNPs位點(diǎn)，分別命名為RS15、RS16、RS17、RS18、RS20、RS21、RS22。在297個大白豬的DNA樣品中，RS15、RS16、RS17、RS18、RS20、RS21、RS22均檢測到多態(tài)性。RS15的3個基因型中TT頻率最高，RS16、和RS21的3個基因型中CC頻率最高，在RS18、RS20的3個基因型中CT頻率最高，RS17、RS22的兩個基因型中分別是CC和AA頻率最高。RS15、RS16、RS17、RS18、RS20、RS21、RS22的優(yōu)勢等位基因分別是T、C、C、G、C、C、A（表4）。RS15、RS16、RS17、RS21和RS22的PIC＜0.25，均屬于低度多態(tài)；RS20的0.25＜PIC＜0.5，屬中度多態(tài)，RS18的PIC＞0.5，屬高度多態(tài)（表5）。在表5中，經(jīng)過Hardy－Weinberg平衡檢驗，RS15、 RS18、RS20、RS21嚴(yán)重偏離了HW平衡，而RS16、RS17、RS22符合Hardy－Weinberg平衡，綜上所述，這3個SNPs遺傳一致。

2.5 單體型分析和主成分分析

利用Hapoview軟件，進(jìn)行D＾/R2連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)RS15和RS16、RS17和RS18、RS20和RS21、RS22分別形成3個具有連鎖遺傳的特性區(qū)域（圖3）。RS15和RS16形成TC、CC和CT 3種單體型，RS17和RS18形成CT、CG、TT和TG 4種單體型，RS20、RS21和RS22形成CCA、TCA、TTA、TTG和CTG 5種單體型（圖4）。利用R Studio的PCA主成分分析程序，對3個生長性狀的所有觀測到的SNPs進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)相同基因型趨于聚集在一起，說明基因型是影響生長性狀的主要遺傳因素（圖5、圖6和圖7）。

表4 基因型和等位基因頻率Table 4 Frequency of genotype and allele

表5 遺傳多樣性分析Table 5 Genetic diversity analysis

圖3 H19基因SNPs的D＾/R2連鎖不平衡分析Fig.3 The linkage disequilibrium analysis of H19gene

圖4 H19基因的單體型Fig.4 The haplotype analysis of H19gene

2.6 SNPs、單體型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用GraphPad對同一性狀不同SNP位點(diǎn)不同基因型之間進(jìn)行Person檢驗，發(fā)現(xiàn)在校正背膘中，各個SNP位點(diǎn)基因型間均無顯著差異。RS15 的TT基因型在達(dá)到100kg時校正日齡要比CT型長3.6d（P＝0.046 2＜0.05），說明RS15的TT基因型顯著影響達(dá)到100kg時校正日齡，即兩者顯著相關(guān)。而在達(dá)到100kg校正眼肌面積中，RS20的CC基因型要比CT型小0.92cm2（P＝0.037 4＜0.05），TT比CT大3.84cm2（P＝0.047 8＜0.05），RS20的CC基因型要比TT型小4.76cm2（P＝0.009 3＜0.01）。獨(dú)立樣本t檢驗表明，RS20位點(diǎn)顯著影響100kg的校正眼肌面積（P＝0.009 5＜0.01），兩者極為顯著相關(guān)（表6）。對單體型進(jìn)行進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在RS15和RS16連鎖的單體型中，TC/CT的校正背膘平均要比CC/CT少2.95cm（P＝0.049 8＜0.05）；在RS17和RS18連鎖的單體型中，CT/CT的校正眼肌面積要比CT/TG大3.09cm2（P＝0.037 1＜ 0.05）。提示RS15與RS16、RS17與RS18的單倍型分別與校正背膘厚、達(dá)100kg的校正眼肌面積顯著相關(guān)（表7）。

圖5 在校正背膘厚中SNPs的PCA分析Fig.5 The PCA analysis in corrected backfat

圖6 在校正日齡中SNPs的PCA分析Fig.6 The PCA analysis in CA100

圖7 在校正眼肌面積中SNPs的PCA分析Fig.7 The PCA analysis in CEMA100

表6 各個SNPs基因型與3個生長性狀的相關(guān)分析Table 6 The relative analysis between genotypes of SNPs and 3growth traits

表7 單體型之間的差異相關(guān)分析Table 7 The relative analysis between the genotypes of haplotypes

3 討 論

豬骨骼肌細(xì)胞主要由肌纖維構(gòu)成。在豬胚胎期14～22d，體節(jié)形成并發(fā)育；胚胎期35d左右，初級肌管（Primary myotubes）形成，并在胚胎期49d左右達(dá)到細(xì)胞增殖高峰；在初級肌管增殖變慢的同時次級肌管（Secondary myotubes）開始形成，到胚胎期91d時，初級肌管消失，次級肌管完成增殖。次級肌管在出生前形成肌纖維，在出生后的2個月里肌纖維完成終末發(fā)育［12－13］。Z.L.Tang等［12］利用LongSAGE技術(shù)比較通城和長白豬在胚胎期33、65 和90d的骨骼肌中篩選了一批與產(chǎn)肉性狀有關(guān)的基因，并鑒定到數(shù)個與產(chǎn)肉性狀相關(guān)的SNPs。之后的時間里，肌纖維數(shù)目不再變化，因此骨骼肌的生長主要是依賴于肌纖維的生長，或者說骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育階段就是從胚胎期到出生后2個月之間的時間。

對豬骨骼肌的相關(guān)基因研究中，MRFs家族中的Myf5（Myogenic factor 5）最先表達(dá)，影響生皮肌節(jié)的發(fā)育，而后MyoD（又稱MyoD1，Myogenic differentiation 1）在生肌節(jié)中表達(dá)，參與決定成肌細(xì)胞的形成［14］。Myog（myogenin）和myf6（MRF4）主要參與成肌細(xì)胞分化為肌纖維的過程［15］。MEFs家族的MEF2a、MEF2b、MEFc和MEFd協(xié)同作用，共同參與成肌細(xì)胞到肌纖維的分化過程［16］。另外，PNAS－4基因可能與早期胚胎發(fā)育中骨骼肌纖維數(shù)目的增加有關(guān)［17］。CA3基因在骨骼肌中具有很高的表達(dá)水平，其多態(tài)性在中外豬種中有顯著差異，并與脂肪含量、瘦肉率相關(guān)［18］。

對豬產(chǎn)肉性狀相關(guān)基因的研究表明，肌纖維類型特異性蛋白TNNI1和TNNI2的表達(dá)水平改變肌纖維的構(gòu)成，進(jìn)而影響豬的產(chǎn)肉性狀，研究還發(fā)現(xiàn)它們的內(nèi)含子上的SNP位點(diǎn)顯著影響背最長肌的pH、肉色、大理石花紋等性狀［19］。bR10D1、HMGA2、NME1、PDGFRA、ERC1 5個基因?qū)Ξa(chǎn)肉性狀有影響，特別是bR10D1、HMGA2、NME1基因與肉色、pH、失水重、剪切力和電導(dǎo)率極顯著相關(guān)，bR10D1更是極顯著的影響瘦肉率、眼肌面積和后腿質(zhì)量［20］。HSP72、ANXA2和cMDH的表達(dá)量可能與屠宰前壓力水平、肌纖維組成密切相關(guān)［21］。

近些年來，LncRNA在骨骼肌生長發(fā)育過程中的作用越來越引起人們的關(guān)注。主要包括eRNAs、Gtl2/MEG3、H19、Linc－MD1、Malat1、Neat1、Nctc1、SRA、Yams和SINE中的lncRNAs。同屬于eRNAs（Enhancer－derived RNAs）的CERNA 和DRRRNA卻通過相反的作用機(jī)制調(diào)控骨骼肌的分化，CERNA通過順式作用激活MyoD，而DRRRNA通過反式作用促進(jìn)MyoG的轉(zhuǎn)錄。Linc－MD1 （Long intergenic noncoding RNA－muscle differentiation 1）是一個骨骼肌特異的lncRNA，通過募集吸附miR－133和miRNA－135，促進(jìn)MEF2C和MAML1（Mastermind－like protein 1）表達(dá)，進(jìn)而影響骨骼肌的分化［18］。Malat1做為myostatin的下游靶基因，參與骨骼肌的生長發(fā)育調(diào)控［19］。SRA （Steroid receptor RNA activator）作為支架將介導(dǎo)骨骼肌發(fā)育的MyoD蛋白與其他因子結(jié)合在一起，從而發(fā)揮生物學(xué)功能［20］。Yams（YY1－associated muscle lincRNAs）可以直接通過表達(dá)影響骨骼肌基因的功能，其中Yams－1編碼的miR－715可以作用于Wnt7b，從而對骨骼肌的形成產(chǎn)生影響［21］。最近，W.M.Zhao等人得到了一系列的在豬胚胎期骨骼肌發(fā)育中起作用的候選LncRNAs［22］。

豬在胚胎期35d時，胎兒基本成形，在35d之后到出生之前組織和器官進(jìn)一步分化和成熟。在胎鼠上，H19基因主要在起源于胚胎期中胚層和內(nèi)胚層的組織中高表達(dá)，包括肝、心、腎周組織、間充質(zhì)細(xì)胞和肌肉［23－24］；在出生后，僅能在骨骼肌中檢測到［25］。這與A.N.Kallen等［23］和B.K.Dey等［9］發(fā)現(xiàn)的H19基因在成年人和小鼠中也有很高表達(dá)量是吻合。在本研究的圖2中可以明顯看到，H19基因在成年豬的組織中也有類似的表達(dá)分布規(guī)律。為了進(jìn)一步驗證H19基因是在骨骼肌生長發(fā)育的特定時期被特異性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的，對骨骼肌的15個時期H19基因的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行檢測，由圖1可以發(fā)現(xiàn)，H19基因主要在胚胎期活躍轉(zhuǎn)錄，出生40d以后表達(dá)量相對極低。表達(dá)水平在胚胎期105d達(dá)到高峰，且極顯著高于其他任何時期（P＜0.001）。目前，據(jù)報道的H19參與骨骼肌發(fā)育過程的兩種途徑：一種是通過反式調(diào)控IGF的表達(dá)，進(jìn)而影響骨骼肌的生長；另一種是通過自身轉(zhuǎn)錄的miR675作用于Smads通路，然后對骨骼肌發(fā)育起到調(diào)控作用。根據(jù)D.E.Gerrard等1998年的研究，IGF2在胚胎期59d表達(dá)達(dá)到峰值，隨著胚胎和胎兒的發(fā)育表達(dá)量逐步降低［26］，這與本試驗中H19的在胚胎期的表達(dá)趨勢相反，提示IGF2表達(dá)量的降低可能與H19被逐步特異性激活轉(zhuǎn)錄有關(guān)。IGF2主要是促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖分化為初級肌管。提示H19主要參與肌管的成熟過程。而在小鼠中，miR675被證實(shí)與H19基因具有共表達(dá)關(guān)系［9］。miR675主要通過直接作用并下調(diào)作用于BMP通路的抗分化轉(zhuǎn)錄因子Smad家族相關(guān)基因的表達(dá)。這種作用和這一時期次級肌管圍繞初級肌管形成并不發(fā)生進(jìn)一步分化成為肌纖維的過程相符合。提示H19基因很可能參與了次級肌管的發(fā)生過程。

在Beckwith－Wiedemann綜合征（BWS）中，位于H19基因第5外顯子的1個SNP位點(diǎn)rs2839703被作為檢測患有BWS并有病理變化的病人的標(biāo)記位點(diǎn)使用［27］。rs10732516對來自于母本的染色體上的H19－ICR區(qū)域的甲基化程度具有潛在影響；與rs2839701、rs10732516連鎖不平衡的rs4930103位點(diǎn)與其特定的CpG島甲基化顯著相關(guān)［28］。通過GWAS方法發(fā)現(xiàn)，rs11897432、rs2412488和rs2555155等3個SNPs也與該區(qū)域的甲基化有關(guān)［29］。H19基因的兩個多態(tài)位點(diǎn)rs2107425、rs2107425的突變與乳腺癌相關(guān)［30］。rs76162918的等位基因頻率在4個日本人群樣本中為0.068～0.088，但在2個韓國人群中卻只有0～0.005；進(jìn)一步的研究顯示，該位點(diǎn)可以作為日本人特有的3個人群標(biāo)記基因之一［31］。在中國人群中，rs217727的T型等位基因?qū)е鹿跔顒用}疾病發(fā)生率上升，然而rs2067051的等位基因卻會減少發(fā)病的風(fēng)險［32］。由上述研究可以看出，H19基因的SNPs與多種疾病有關(guān)，而對豬產(chǎn)肉性狀，特別是骨骼肌相關(guān)的生長性狀的候選SNP篩選報道甚少。根據(jù)本試驗研究結(jié)果，RS20 3個基因型間的個體表型均值間差異都顯著，可以作為達(dá)100kg體重時的校正眼肌面積的候選標(biāo)記位點(diǎn)，在豬中由于眼肌面積與瘦肉率呈正相關(guān)，因此，可以作為篩選高瘦率的候選位點(diǎn)，瘦肉率在屠宰胴體中主要是指骨骼肌占酮體重的比例，提示H19基因的點(diǎn)突變對骨骼肌的生長具有重要影響。骨骼肌的生長主要依賴于在豬出生后肌纖維的增肥，如前文所提及的，H19在豬出生后只在骨骼肌中特異性表達(dá)，綜上所述，H19基因可能參與了肌纖維的出生后生長。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ FUJII J，OTSU K，ZORZATO F，et al.Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia［J］.Science，1991，253 （5018）：448－451.

［2］ MILAN D，JEON J T，LOOFT C，et al.A mutation in PRKAG3associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle［J］.Science，2000，288（5469）：1248－1251.

［3］ RANNAN C I，DEES E C，INGRAM R S，et al.The product of the H19gene may function as an RNA［J］.Mol Cell Biol，1990，10（1）：28－36.

［4］ SEIDL C I，STRICKER S H，BARLOW D P.The imprinted Air ncRNA is an atypical RNAPII transcript that evades splicing and escapes nuclear export［J］.EMBO J，2006，25（15）：3565－3575.

［5］ SMITS G，MUNGALL A J，GRIFFITHS－JONES S，et al.Conservation of the H19noncoding RNA and H19－IGF2imprinting mechanism in therians［J］.Nat Genet，2008，40（8）：971－976.

［6］ CAI X，CULLEN B R.The imprinted H19noncoding RNA is a primary microRNA precursor［J］.RNA，2007，13（3）：313－316.

［7］ KENIRY A，OXLEY D，MONNIER P，et al.The H19 lincRNA is a developmental reservoir of miR－675that suppresses growth and Igf1r［J］.Nat Cell Biol，2012，14（7）：659－665.

［8］ KALLEN A N，ZHOU X B，XU J，et al.The imprinted H19lncRNA antagonizes let－7microRNAs［J］.Mol Cell，2013，52（1）：101－112.

［9］ DEY B K，PFEIFER K，DUTTA A.The H19long noncoding RNA gives rise to microRNAs miR－675－3p and miR－675－5p to promote skeletal muscle differentiation and regeneration［J］.Genes Dev，2014，28（5）：491－501.

［10］ LI Z Z，GILBERT J A，ZHANG Y Y，et al.An HMGA2－IGF2BP2axis regulates myoblast proliferation and myogenesis［J］.Dev Cell，2012，23（6）：1176－1188.

［11］ TANG Z L，LIANG R Y，ZHAO S P，et al.CNN3is regulated by microRNA－1during muscle development in pigs［J］.Int J Biol Sci，2014，10（4）：377－385.

［12］ TANG Z L，LI Y，WAN P，et al.LongSAGE analysis of skeletal muscle at three prenatal stages in Tongcheng and Landrace pigs［J］.Genome Biol，2007，8（6）：R115.

［13］ ASHMORE C R，ADDIS P B，DOERR L.Development of muscle fibers in the fetal pig［J］.J Anim Sci，1973，36（6）：1088－1093.

［14］ TAJBAKHSH S，BORELLO U，VIVARELLI E，et al.Differential activation of Myf5and MyoD by different Wnts in explants of mouse paraxial mesoderm and the later activation of myogenesis in the absence of Myf5［J］.Development，1998，125（21）：4155－4162.

［15］ RIDGEWAY A G，PETROPOULOS H，WILTON S，et al.Wnt signaling regulates the function of MyoD and myogenin［J］.J Biol Chem，2000，275（42）：32398－32405.

［16］ BLACK B L，OLSON E N.Transcriptional control of muscle development by myocyte enhancer factor－2 （MEF2）proteins［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，1998，14：167－196.

［17］ MO D，ZHU Z，TE PAS M F，et al.Characterization，expression profiles，intracellular distribution and association analysis of porcine PNAS－4gene with production traits［J］.BMC Genet，2008，9：40.

［18］ WANG H L，ZHU Z M，WANG H，et al.Molecular characterization and association analysis of porcine CA3［J］.Cytogenet Genome Res，2006，115（2）：129－133.

［19］ YANG H，XU Z Y，LEI M G，et al.Association of 3 polymorphisms in porcine troponin I genes（TNNI1 and TNNI2）with meat quality traits［J］.J Appl Genet，2010，51（1）：51－57.

［20］ WIMMERS K，MURANI E，NGU N T，et al.Structural and functional genomics to elucidate the genetic background of microstructural and biophysical muscle properties in the pig［J］.J Anim Breed Genet，2007，124（Suppl 1）：27－34.

［21］ KWASIBORSKI A，ROCHA D，TERLOUW C.Gene expression in Large White or Duroc－sired female and castrated male pigs and relationships with pork quality［J］.Anim Genet，2009，40（6）：852－862.

［22］ ZHAO W M，MU Y L，MA L，et al.Systematic identification and characterization of long intergenic noncoding RNAs in fetal porcine skeletal muscle development［J］.Sci Rep，2015，5：8957.

［23］ KALLEN A N，ZHOU X B，XU J，et al.The imprinted H19lncRNA antagonizes let－7microRNAs［J］.Mol Cell，2013，52（1）：101－112.

［24］ PACHNIS V，BELAYEW A，TILGHMAN S M.Locus unlinked to alpha－fetoprotein under the control of the murine raf and Rif genes［J］.Proc Natl Acad SciU S A，1984，81（17）：5523－5527.

［25］ POIRIER F，CHAN C T，TIMMONS P M，et al.The murine H19gene is activated during embryonic stem cell differentiation in vitro and at the time of implantation in the developing embryo［J］.Development，1991，113（4）：1105－1114.

［26］ GERRARD D E，OKAMURA C S，RANALLETTA M A，et al.Developmental expression and location of IGF－I and IGF－II mRNA and protein in skeletal muscle［J］.J Anim Sci，1998，76（4）：1004－1011.

［27］ HIGASHIMOTO K，NAKABAYASHI K，YATSUKI H，et al.Aberrant methylation of H19－DMR acquired after implantation was dissimilar in soma versus placenta of patients with Beckwith－Wiedemann syndrome［J］.Am J Med Genet A，2012，158A（7）：1670－1675.

［28］ COOLEN M W，STATHAM A L，QU W，et al.Impact of the genome on the epigenome is manifested in DNA methylation patterns of imprinted regions in monozygotic and dizygotic twins［J］.PLoS One，2011，6（10）：e25590.

［29］ RENTERíA M E，COOLEN M W，STATHAM A L，et al.GWAS of DNA methylation variation within imprinting control regions suggests parent－of－origin association［J］.Twin Res Hum Genet，2013，16（4）：767－781.

［30］ O’BRIEN K M，COLE S R，POOLE C，et al.Replication of breast cancer susceptibility loci in whites and African Americans using a Bayesian approach［J］.Am J Epidemiol，2014，179（3）：382－394.

［31］ YUASA I，UMETSU K，ADACHI N，et al.Investigation of Japanese－specific alleles：most are of Jomon lineage［J］.Leg Med（Tokyo），2015，17（1）：52－55.

［32］ GAO W，ZHU M，WANG H，et al.Association of polymorphisms in long non－coding RNA H19with coronary artery disease risk in a Chinese population ［J］.Mutat Res，2015，772：15－22.

（編輯 郭云雁）

The Correlation between H19Single Nucleotide Polymorphism and Pig Growth Characters and Its Spatio－temporal Expression

SUN Hao1，WANG Zi－shuai2，XU Yin－xue1*，TANG Zhong－lin2*
（1.College of Animal Science ＆Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing210095，China；2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

Abstract：An attempt was made to reveal the function of H19gene in skeletal muscle development in pigs in this study.The distribution of H19in different tissues and dynamic expression at different developmental stages in skeletal muscle were determined by Quantitative real－time PCR（qRTPCR）.The sites of single nucleotide polymorphisms（SNPs）in its exons and introns were identified by pool DNA sequencing，and individual SNPs were genotyped using mass spectrum in Large White pig population.The trait－marker association analysis was carried out between H19genotypes and growth performance.The expression profiles showed that H19RNA was expressed in all tissues detected，including heart，liver，spleen，lung，kidney，intestine，stomach and skeletal muscle（leg muscle and longissimus muscle），with remarkably high expression in skeletal muscle and kidney.Meanwhile，H19expression existed only before postnatal 40days and reached the peak at 105days in embryo period during the development of skeletal muscle.Correlation analysis between SNPs and traits showed the RS15was significantly associated with corrected age of animals with body weight of 100kg（P＝0.046 2＜0.05），RS20was associated with the corrected eyemuscle area of animals with body weight of 100kg（P＝0.009 5＜0.01）；The correlation analysis between haplotypes and traits shown that RS15had a close linkage with RS16，and their haplotype was significantly correlated with corrected backfat thickness（P＝0.049 8＜0.05）.RS17was closely linked to RS18，and their haplotype was also significantly correlated with corrected eye muscle area of animals with body weight of 100kg（P＝0.037 1＜0.05）.In conclusion，H19gene is involved in regulation of pig skeletal muscle development and is a candidate gene for meat traits.

Key words：pig；long non－coding RNA；H19；skeletal muscle；growth traits

中圖分類號：S828；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0870－12

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.003

收稿日期：2015－05－28

基金項目：轉(zhuǎn)基因重大專項（2014ZX08009－001）；國家自然科學(xué)基金（31330074；31171192）

作者簡介：孫 浩（1989－），男，山東萊蕪人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E－mail：littlesun2015@126.com

*通信作者：徐銀學(xué)，教授，E－mail：xuyinxue@njau.edu.cn；唐中林，研究員，E－mail：zhonglinqy＿99@sina.com