楊彬彬，王雨舟，郭 輝，張 冰，張大丙

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193 ； 2. 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津南開(kāi)300071)

鴨星狀病毒單克隆抗體的制備及鑒定

楊彬彬1，王雨舟2，郭 輝1，張 冰1，張大丙1

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193 ； 2. 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津南開(kāi)300071)

為了制備針對(duì)鴨星狀病毒(Duckastrovirus, DAstV)衣殼蛋白的單克隆抗體，以DAstV C-NGB株為免疫原，用ORF2重組蛋白作為抗原進(jìn)行篩選，獲得7株穩(wěn)定分泌抗DAstV ORF2蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞。取E5C1株和C10F6株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，2株單抗均為IgM，輕鏈均為κ型；細(xì)胞上清和小鼠腹水的效價(jià)分別為105和106以上；免疫印跡試驗(yàn)表明，2株單抗均能識(shí)別重組ORF2蛋白；特異性試驗(yàn)表明，E5C1株雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清只與DAstV反應(yīng)。

鴨星狀病毒 ； 單克隆抗體 ； ORF2蛋白

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)是危害養(yǎng)鴨業(yè)的高度致死性傳染病，其病原包括小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲肝病毒和星狀病毒科禽星狀病毒屬的鴨星狀病毒(Duckastrovirus, DAstV)。其中，DAstV指歷史上所稱(chēng)的鴨肝炎病毒血清2型和3型[1-7]。一般認(rèn)為，僅英國(guó)和美國(guó)發(fā)生過(guò)DAstV感染引起的DVH[1-7]，而付余(2008)的研究結(jié)果表明，我國(guó)江蘇已出現(xiàn)由DAstV引起的DVH[8]。對(duì)基因組部分序列進(jìn)行比較的結(jié)果表明，我國(guó)的DAstV毒株(C-NGB株)可能屬于鴨肝炎病毒血清2型[8]。迄今為止，DAstV的檢測(cè)方法仍十分缺乏。通常認(rèn)為電鏡技術(shù)是診斷DAstV感染最可靠的診斷方法，但該法不適用于大量樣品的檢測(cè)。為建立快速的檢測(cè)方法，本研究以DAstV C-NGB株為材料，制備了針對(duì)衣殼蛋白的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 DAstV C-NGB株、鴨甲肝病毒、鴨瘟病毒均由本實(shí)驗(yàn)室保存，番鴨細(xì)小病毒、禽副黏病毒1型均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院王永坤教授惠贈(zèng)，SP2/0細(xì)胞株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所病毒室張國(guó)中教授惠贈(zèng)；8周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 純化的DAstV ORF2重組蛋白由本室制備并保存。HAT、HT選擇培養(yǎng)基，購(gòu)自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜，購(gòu)自GIBCO BRL公司；Clonotyping System(5300-05)，購(gòu)自Southern Biotech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgM，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 免疫原的制備 取DAstV C-NGB株病毒液，10 000 r/min (4℃)離心30 min，收集上清，在上清液中緩緩加入氯仿至40%，充分混勻后，置于4 ℃ 1 h，5 000 r/min離心20 min，取水相，10 000 r/min離心30 min，棄沉淀，再以25 000 r/min(4℃)離心3 h，收集上清，沉淀用1%原體積的10 mmol/L PBS緩沖液(pH值7.4)溶解，貯存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)物免疫 將抗原和弗氏完全佐劑等量混合，充分乳化，經(jīng)頸背部皮下多點(diǎn)注射方式免疫8周齡BALB/c小鼠，此后，每隔2周，用加弗氏不完全佐劑的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫，在進(jìn)行脾細(xì)胞融合前3 d，用抗原液經(jīng)腹腔再免疫1次。

1.5 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 以O(shè)RF2重組蛋白作為包被抗原，首先通過(guò)方陣試驗(yàn)確定抗原最佳包被濃度和陰陽(yáng)性血清稀釋度，再按常規(guī)程序建立檢測(cè)抗體的間接ELISA，經(jīng)酶標(biāo)儀讀取OD450nm，選擇P/N值較大且陽(yáng)性血清OD值在1左右、陰性血清OD值較低的條件為最佳條件。

1.6 雜交瘤細(xì)胞株的建立 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，與免疫鼠脾細(xì)胞按照1∶5的比例混合，以50% PEG4000為融合劑按常規(guī)方法進(jìn)行融合。低速離心后，棄上清，用含20%血清和1%HAT的DMEM培養(yǎng)基重懸，加入鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，100 μL/孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日記錄生長(zhǎng)情況。每隔2 d換液1次(換液量為50%)，2周后用含1%HT的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆生長(zhǎng)到覆蓋細(xì)胞孔底部1/4～1/3時(shí)，用間接ELISA法對(duì)上清進(jìn)行檢測(cè)，采用有限稀釋法對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。3次亞克隆后對(duì)穩(wěn)定分泌抗體且效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)和凍存。挑選經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油，0.5 mL/只。14 d后，經(jīng)腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，106個(gè)/只。7～10 d后，取腹水，離心收集上清，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞加入秋水仙素溶液，通過(guò)低滲處理、預(yù)固定、固定、再固定、制片和染色制備細(xì)胞染色體，在顯微鏡下計(jì)算染色體的數(shù)目，并照相記錄[10]。

1.7.2 亞類(lèi)及輕鏈種類(lèi)的鑒定 按照鼠單抗分型試劑盒介紹的操作步驟進(jìn)行。

1.7.3 效價(jià)的測(cè)定 分別將雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)瑴y(cè)定其ELISA效價(jià)。

1.7.4 免疫印記試驗(yàn) 按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE。以1∶100稀釋的小鼠腹水為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.7.5 特異性試驗(yàn) 用2 μg/mL ORF2重組蛋白為包被抗原，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM為二抗，用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與鴨星狀病病毒、鴨甲肝病病毒、鴨瘟病毒、番鴨細(xì)小病病毒和禽副黏病病毒1型的交叉反應(yīng)性。

1.7.6 穩(wěn)定性檢測(cè) 將雜交瘤細(xì)胞分別凍存3個(gè)月和6個(gè)月，進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，用間接ELISA檢測(cè)上清中的抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠免疫抗體的檢測(cè) 用間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，經(jīng)4次免疫后，小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶8 000以上，在最后一次免疫后3 d，取效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。

2.2 雜交瘤細(xì)胞篩選方法的建立 通過(guò)方陣法確定ORF2重組蛋白的最佳包被濃度為2 μg/mL，血清稀釋度為1∶800，最佳包被條件為4 ℃過(guò)夜，最佳封閉液為1%BSA，陰陽(yáng)性臨界值為0.096。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立 融合后第3天可見(jiàn)有細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，1周后有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的孔占80%以上。用間接ELISA篩選出的強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)3次亞克隆，得到7株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為E5C1、C10F6、A9D10、D3E1、E3G1、F10C7和G3H7。

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù) BALB/c小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40條，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)為60～70條。用10% Giemsa染液染色后，對(duì)E5C1株雜交瘤細(xì)胞染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)，平均值為100條。

2.4.2 亞類(lèi)及輕鏈種類(lèi)的鑒定 用Southern Biotech分型試劑盒鑒定，單克隆抗體E5C1和C10F6株均是IgM亞類(lèi)，其輕鏈均為κ型。

2.4.3 效價(jià)的測(cè)定 用間接ELISA分別對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，2株單抗培養(yǎng)上清的效價(jià)為1∶105，腹水的效價(jià)為1∶106以上。

2.4.4 免疫印記試驗(yàn) Western Blotting結(jié)果顯示，單克隆抗體E5C1和C10F6株能特異性地識(shí)別52 kDa的DAstV ORF2重組蛋白(圖1)。

2.4.5 特異性試驗(yàn) E5C1株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與DAstV反應(yīng)的OD值(1.328)明顯高于與鴨甲肝病毒、鴨瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒、禽副黏病毒反應(yīng)的OD值(0.081～0.158)。結(jié)果說(shuō)明，E5C1株單抗可特異性識(shí)別DAstV。

2.4.6 穩(wěn)定性檢測(cè) 將單克隆抗體E5C1株的雜交瘤細(xì)胞保存6個(gè)月后，經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)，其上清中的抗體效價(jià)仍然大于1∶105。

圖1 兩株單克隆抗體與ORF2蛋白反應(yīng)性的鑒定

1：C10F6； 2：E5C1； M：蛋白Marker

3 討論

迄今為止，DAstV的分離培養(yǎng)較為困難，本試驗(yàn)采用純化的含毒組織研磨液作為免疫原免疫小鼠，以O(shè)RF2重組蛋白作為篩選抗原，既保證了免疫所需的病毒量，又便于篩選出衣殼蛋白的抗體，免疫印記試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了該結(jié)果。

本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)、有限稀釋法獲得了7株雜交瘤細(xì)胞。在ELISA篩選過(guò)程中，為了避免菌體自身蛋白和His標(biāo)簽蛋白的干擾，所有篩選的陽(yáng)性克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清都已用pET-32a(+)空載體表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了排除。對(duì)單克隆抗體E5C1和C10F6株進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示，它們均屬I(mǎi)gM亞類(lèi)，其輕鏈均為κ型，篩選出IgM型單抗可能與DAstV ORF2蛋白免疫機(jī)制有關(guān)。本研究結(jié)果為下一步研究ORF2蛋白的免疫保護(hù)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為探索新的DAstV快速診斷方法提供一個(gè)新思路。

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Preparation andidentification of Monoclonal Antibodies against Duck Astrovirus

YANG Bin-bin1, WANG Yu-zhou2, GUO Hui1, ZHANG Bing1, ZHANG Da-bing1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2.College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China)

For preparing monoclonal antibodies (Abs) against duck astrovirus (DAstV) capsid protein, the DAstV C-NGB isolate was used as immunogen and the purified recombinant ORF2 protein as antigen to secreen specific antibodies. Seven hybridoma cell lines that stably secreted Abs against DAstV ORF2 were obtained. Two selected Abs, namely E5C1 and C10F6, were identified as IgM with light chains belonging to κ type. The titers of both Abs in cell culture supernatants and ascites were determined to be 1:105and 1:106， respectively. The reactions of the E5C1 and C10F6 Abs with the recombinant ORF2 protein were confirmed by Western Blotting. The E5C1Ab in culture supernatants was tested to react only with DAstV in specificity tests.

Duck astrovirus; Monoclonal antibody; ORF2 protein

s： ZHANG Da-bing； ZHANG Bing

2014-10-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201003012)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)資金(CARS-43)

楊彬彬(1986-)，女，碩士，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，E-mail：binbinyang1986@163.com

張大丙，E-mail：zdb@cau.edu.cn；張冰，E-mail：zhangdb@cau.edu.cn

S852.65+9.6

A

0529-6005(2017)04-0007-02