岳 敏，田雨光，萬 斌，龐 煒，吳清洪，王玉玨

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生長激素受體基因突變對西藏藏豬生長遲緩的影響

岳 敏＃，田雨光＃，萬 斌，龐 煒，吳清洪*，王玉玨*

（南方醫(yī)科大學實驗動物中心，廣州510515）

摘 要：本研究旨在探索西藏藏豬生長遲緩成因和分子機理。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）技術對西藏藏豬生長激素受體（GHR）基因克隆，采用生物信息學方法分析西藏藏豬生長激素受體基因與其他常見品種豬基因與蛋白序列差異，并構建GHR基因的真核過表達質粒，轉染到西藏藏豬胚胎成纖維細胞（PEFs）上進行瞬時表達，通過MTT檢測細胞增殖活性，利用實時熒光定量PCR技術檢測細胞的胰島素樣生長因子－1（IGF－1）表達的情況。西藏藏豬GHR基因編碼區(qū)1 716bp，編碼572個氨基酸；與普通豬GHR基因序列進行比對分析表明，在西藏藏豬GHR基因編碼區(qū)1 225bp處發(fā)生T→G突變，導致絲氨酸突變?yōu)楸彼?；GHR基因真核過表達質粒成功轉染PEFs后，PEFs生長活性顯著提高；qPCR檢測表明，細胞株中IGF－1表達顯著上調。綜上表明，GHR基因的表達可以提高PEFs細胞的增殖活性，誘導IGF－1基因的表達，GHR基因在1 225bp處的點突變可能影響西藏藏豬的生長遲緩。

關鍵詞：西藏藏豬；GHR；IGF－1；胚胎成纖維細胞

動物的生長是一個復雜的生理過程，受到體內外多種因素的影響。其中由GHRH－GH－IGF構成的神經(jīng)內分泌生長軸是調控的關鍵［1－4］。生長激素（Growth hormone，GH）分泌后與生長激素結合蛋白（Growth hormone binding protein，GHBP）結合，經(jīng)血液循環(huán)運輸?shù)襟w內各組織器官，與靶器官上的生長激素受體（Growth hormone receptor，GHR）結合，啟動細胞內的信號轉導機制，促進胰島素樣生長因子－1 （IGF－1）的表達［5－7］。IGF－1主要由肝合成后釋放到血液中，再與胰島素樣生長因子結合蛋白結合運輸至動物體內的多種組織，促進蛋白質的合成，促進細胞增殖，從而促進動物以骨骼肌為主的生長發(fā)育［8－10］。

西藏藏豬來源于青藏高原，是非常純正的小型豬品種，成年的體重僅25～40kg，是普通豬體重的15%～20%［11］。從免疫學、遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，該品系具有獨特的免疫相關指標和遺傳特征，加上其獨特的外形，是一種優(yōu)良的試驗用小型豬品種，研究其生長發(fā)育具有特別意義。本研究通過對普通豬的生長相關基因GHR進行克隆，構建其野生型真核表達質粒和突變型過表達質粒，并在西藏藏豬胚胎成纖維細胞中表達，旨在研究導致西藏藏豬生長遲緩成因，從而為進一步探討西藏藏豬GHR基因的功能及信號的轉導提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

6月齡西藏藏豬肝組織取自南方醫(yī)科大學實驗動物中心（SCXK（粵）2011－0015），麻醉后，活體取部分肝，置于去RNA酶的1.5mL EP管中，做好標記后，立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

克隆菌株JM109（北京Solarbio公司）；DH5α感受態(tài)細胞、真核熒光表達質粒：pIRES2－EGFP（北京天恩澤基因科技有限公司）；Prime Script RTPCR Kit、pMD 18TVector、T4－ligase（TaKaRa公司）；質粒提取試劑盒（北京天根生物公司；SalⅠ、NheⅠ內切酶（Fermentas公司）；Lipofectamine2000和Opti－MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 GHR基因的克隆 參照GenBank豬GHR基因mRNA序列（Gene accession：NM＿214254.2）設計克隆引物，由上海捷瑞生物技術有限公司合成，正向引物：CTAGCTAGCGCCACCATGGATCTC（含NheⅠ酶切位點），反向引物：GCGTCGACCTAAGGCATGATTTTGTTC（含SalⅠ的酶切位點）。以普通大型肉食豬cDNA為模板進行擴增。通過1%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果，回收目的DNA片段。

1.2.2 GHR基因真核表達載體的構建 PCR產(chǎn)物和pIRES2－EGFP進行雙酶切連接，連接的反應液于4℃過夜，然后在感受態(tài)細胞中轉化，挑選單個菌落進行擴大培養(yǎng)，進行PCR鑒定，鑒定正確后測序。測序鑒定正確的重組質粒GHR－pIRES2－EGFP，經(jīng)感受態(tài)細胞轉化后，提取表達質粒。

1.2.3 重組質粒轉染西藏藏豬胚胎成纖維細胞

操作按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行。使用24孔板準備細胞，轉染前1d，對細胞株進行傳代，使其匯合度為70%～80%，第2天進行轉染。細胞轉染前30min，在離心管中制備A、B液，A液：用OPTI－MEM稀釋每個孔質粒1μg，總量100μL，B液：取1μL Lipofectamine2000溶解于OPTI－MEM培養(yǎng)基中，室溫放置5min，輕輕混合A、B液，室溫孵育20min。孵育4～6h后，換為細胞生長培養(yǎng)基。24h后倒置熒光顯微鏡下熒光拍照，并收集細胞。

1.2.4 相關基因表達量檢測 以細胞總RNA反轉錄產(chǎn)物為模板，采用熒光定量的方法，對pIRES2－EGFP和GHR－pIRES2－EGFP質粒轉染后48h的西藏藏豬的胚胎成纖維細胞IGF－1以及Leptin基因進行熒光定量分析。目的基因與內參基因引物：IGF－1－F：5′－CGTGCTGGAACCACCTTA－CT－3′，IGF－1－R：5′－CGTGCTGGAACCACCTTA－CT－3′；Leptin－F：5′－GACCCCTGTGCCGATTCCTG－3′，Leptin－R：5′－CAGGACAGGATGGAGCCCA－3′；β－actin－F：5′－AGGGAAATCGTGCGTGACA－3′，β－actin－R：5′－GAACCGCTCATTGCCGATA－3′。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書進行分析，重復3次。

1.2.5 MTT檢測 用0.25%胰酶消化轉染后的細胞，輕搖成細胞懸液，調節(jié)細胞濃度每孔為105個，接種于48孔細胞板上，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去舊的培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，之后每孔加入無血清RPMI－1640培養(yǎng)液100μL和5mg·mL－1的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用移液槍小心吸出孔內液體，每孔加入150μL的DMSO，放入酶標儀中，37℃振蕩孵育10min，促進結晶物充分溶解。每24h于分光光度計490nm處測定每孔的吸光度OD值，每組平行3次，計算并繪制細胞生長曲線。

2 結 果

2.1 西藏藏豬GHR基因序列生物信息學分析

基因測序及生物信息數(shù)據(jù)分析，GHR基因編碼區(qū)1 716bp，編碼572個氨基酸，基因的編碼序列與版納微型豬（JF276446.1）、五指山小型豬（DQ422962.1）的GHR基因高度同源達99%，西藏藏豬GHR基因編碼區(qū)與普通豬GHR基因（NM＿214254.2）序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，西藏藏豬基因1 225bp處發(fā)生了T→G突變，此突變造成409aa處的絲氨酸變?yōu)楸彼岬耐蛔儯▓D1），通過SWISSMODEL軟件對西藏藏豬與普通豬GHR蛋白進行建模后比對發(fā)現(xiàn)，西藏藏豬GHR蛋白在空間結構上與普通豬具有較為明顯的差異（圖2黑色箭頭處）。

圖1 不同品種豬GHR氨基酸的序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of GHR in different pig breeds

圖2 不同品種豬GHR蛋白的空間結構比對（SWISS－MODEL）Fig.2 Protein spatial structure alignment of GHR in different pig breeds

2.2 重組質粒在胚胎成纖維細胞中的過表達

取質粒pIRES2－EGFP和pIRES2－EGFP－GHR轉染48h的西藏藏豬的胚胎成纖維細胞，熒光共聚焦顯微鏡下拍照發(fā)現(xiàn)pIRES2－EGFP（圖3A～C）和pIRES2－EGFP－GHR（圖3D～F）質粒在胚胎成纖維細胞中均有表達。

2.3 GHR對西藏藏豬胚胎成纖維細胞增殖的影響

經(jīng)MTT檢測發(fā)現(xiàn)，西藏藏豬胚胎成纖維細胞經(jīng)轉染GHR基因過量表達載體后，其細胞生長活性明顯較空白對照組與GFP空載體組為高（圖4）。

圖3 西藏藏豬胚胎成纖維細胞轉染EGFP質粒后熒光觀察（10×10）Fig.3 Eukaryotic expression after transfection 48hin embryo fibroblast of Tibet mini－pig（10×10）

圖4 西藏藏豬胚胎成纖維細胞活性檢測Fig.4 Activity of embryo fibroblast of Tibet mini－pig

2.4 GHR對IGF－1mRNA表達量的影響

轉染生長激素受體基因后，西藏藏豬的胚胎成纖維細胞中的GHR與IGF－1mRNA相對表達量顯著上調（P＜0.05），這表明西藏藏豬生長激素受體基因能在體外誘導IGF－1的表達；而各組間瘦素lepin基因mRNA相對表達量無顯著差異（P＞0.05）（圖5）。這進一步表明，西藏藏豬GHR可以通過影響IGF－1的表達從而引起西藏藏豬生長遲緩，此過程與瘦素基因的表達關系不明顯。

圖5 西藏藏豬胚胎成纖維細胞mRNA相對表達Fig.5 The relative expression of mRNA of Tibet mini－pig embryo fibroblasts

3 討 論

豬GHR是由單一基因編碼的跨膜糖蛋白，其編碼GHR的基因定位于16號染色體的NC＿010458.3位置，全長212kb，共包含10個外顯子，外顯子1編碼信號肽，外顯子2～7編碼GHR細胞外區(qū)域，外顯子8編碼跨膜區(qū)域，外顯子9～10編碼細胞內區(qū)域，剪切成熟的GHR mRNA共計編碼572個氨基酸［12］。早期對GHR基因研究，絕大多數(shù)集中在對人類自身的研究上，而對西藏藏豬生長遲緩的原因探索較少。人的GHR蛋白屬細胞因子受體超家族成員，是由630個氨基酸殘基構成的單鏈糖蛋白，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)3個部分［13］。胞外區(qū)包含與GH 結合的位點，同時也是GH結合蛋白的前體，迄今為止，在已有人類的絕大多數(shù)關于GHR基因的突變，均位于GHR的胞外區(qū)；跨膜區(qū)較短小，只形成一次跨膜；胞內區(qū)是細胞信號轉導的功能區(qū)。GH與特異性GHR結合，進而激活受體后信號轉導系統(tǒng)而發(fā)揮促生長的生物學效應［14－16］。

本研究通過對普通豬與西藏藏豬的GHR基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，西藏藏豬GHR基因在1 225bp處發(fā)生T→G的突變，該位點的突變引起相應編碼氨基酸的變化，由絲氨酸變成丙氨酸，從而使GHR基因所表達的蛋白，出現(xiàn)結構上的差異。GH能促進動物生長發(fā)育，其在體內表達后必須與靶器官上的GH受體（GHR）結合才能發(fā)揮作用，GH與GHR正常結合后，將激活下游信號通路，其中IGF－1是下游信號通路中較為重要的物質，其直接影響蛋白質的合成以及細胞的增殖。如果GHR基因發(fā)生突變而引起其編碼蛋白發(fā)生結構變異，將直接影響動物的生長發(fā)育。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)西藏藏豬的生長激素受體基因發(fā)生突變位于1 225 bp處，同樣屬于GHR的胞外區(qū)，這一突變直接影響GHR蛋白的折疊結構，將大大降低其與胞外生長激素的結合率，通過這一信號通路的抑制作用，將直接影響西藏藏豬的生長遲緩?；诖?，本研究通過克隆普通大型肉用型豬的生長激素受體基因GHR，將其構建成真核過量表達質粒 GHR－pIRES2－EGFP，并將質粒轉染到西藏藏豬胚胎成纖維細胞中，使GHR基因的表達量得到提高。生長激素受體表達提高后，自然與之結合的生長激素也會增加，將進一步增強生長激素在細胞內的信號轉導機制，促進IGF－1表達，引起IGF－1基因表達量上調。該結果與鄧景致［17］構建的pGHR－pIRES2－EGFP質粒轉染到豬腎PK－15細胞內IGF－1表達有上調現(xiàn)象相一致。正常情況下，西藏藏豬GHR的表達對IGF－1的表達上調作用顯著低于普通大型食肉豬；而通過克隆普通大型食肉豬GHR轉化到西藏藏豬胚胎成纖維細胞后，西藏藏豬胚胎成纖維細胞的生長活性得到顯著提高，同時，調節(jié)細胞生長的關鍵因子IGF－1的表達也顯著上調，說明GHR基因點突變時導致其生長遲緩，因此，可推斷西藏藏豬的GHR基因1 225bp處T→G的突變，造成編碼氨基酸的變化而導致下游IGF－1表達降低，進而導致西藏藏豬生長發(fā)育遲緩。

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（編輯 程金華）

The Impact of GHR Mutation on Suppressing the Growth in Tibet Mini－pig

YUE Min＃，TIAN Yu－guang＃，WAN Bin，PANG Wei，WU Qing－h(huán)ong*，WANG Yu－jue*
（Laboratory Animal Center，Southern Medical University，Guangzhou510515，China）

Abstract：This study aimed to explore the genetic and molecular mechanism of Tibet mini－pig growth retardation.RT－PCR technique was used to amplify Tibet mini－pig GHRgene.Bioinformatics method was used to analyze the differences of GHRgene and protein sequence between Tibet mini－pig and other common variety pigs.The eukaryotic expression vector of common pig GHRgene was transfected into Tibet mini－pig’s embryonic fibroblasts.The MTT assay was used to detect the cell proliferation activity after transfected GHR－pIRES2－EGFP vector.The real－time PCR was used to detect the mRNA expression of the IGF－1gene.There were 1 716bp in Tibet mini－pig GHRgene coding region，and 572amino acids were encoded.Compared with common meat pig GHRgene sequence，the base T in Tibet mini－pig GHRgene coding region 1 225bp mutated into G，and then serine was replaced by alanine.The growth activity of Tibet mini－pig’s embryonic fibroblasts were significantly improved after transfected with GHR－pIRES2－EGFP，and the mRNA level of IGF－1was up－regulated significantly.The results showed that GHRcould improve the activity of PEFs cell proliferation，and induce the expression of IGF－1gene；The mutation of GHRgene in 1 225bp might involve in the process of growth retardation in Tibet mini－pig.

Key words：Tibet mini－pig；GHR；IGF－1；embryonic fibroblasts

中圖分類號：S828.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0882－06

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.004

收稿日期：2015－10－12

基金項目：國家自然科學基金（801402625）；中國博士后自然科學基金（2014M550439）；廣東省自然科學基金（S2013010014720）；廣東省科技計劃項目（2011B060300014）；南方醫(yī)科大學2015科研助手項目（C1032246）

作者簡介：岳 敏（1982－），醫(yī)學博士，實驗師，主要從事實驗動物分子遺傳學研究和人類疾病動物模型制作研究，Tel：020－62789009，E－mail：343779791@qq.com；田雨光（1987－），博士生，主要從事比較醫(yī)學研究，Tel：020－62789009，E－mail：yuguang.tian@qq.com。岳 敏和田雨光為共同第一作者

*通信作者：吳清洪，高級實驗師，主要從事實驗動物學研究，Tel：020－61648424，E－mail：wuqhvip@126.com；王玉玨，醫(yī)學博士，副教授，主要從事人類疾病動物模型制作研究，Tel：020－62789158，E－mail：75848808@qq.com