陳伯祥，楊 明，賀泂杰，李 杰

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

抗山羊痘病毒P32蛋白雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建及其單克隆抗體的制備

陳伯祥1，楊 明1，賀泂杰2，李 杰1

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

本研究旨在以純化的山羊痘病毒P32蛋白為免疫原，構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞株，制備P32蛋白單克隆抗體。用純化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，構(gòu)建抗山羊痘病毒P32蛋白的雜交瘤細(xì)胞，制備P32蛋白單克隆抗體，獲得4株能識(shí)別重組蛋白且特異性強(qiáng)無(wú)交叉反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，腹水抗體效價(jià)均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建及單克隆抗體的制備為進(jìn)一步開(kāi)展檢測(cè)方法研究提供了材料。

山羊痘病毒；P32蛋白；雜交瘤細(xì)胞；單克隆抗體

山羊痘是由山羊痘病毒（goat poxvirus，GTPV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，病羊以發(fā)熱、全身起痘、呼吸道和消化道損傷以及淋巴結(jié)腫大為特征。近年來(lái)，山羊痘在我國(guó)陜西、甘肅、四川、貴州、云南、內(nèi)蒙古、福建、江蘇等省（自治區(qū)）均有發(fā)生和流行的報(bào)道，對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

山羊痘病毒基因組大小為143 kb～147 kb，共有147個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼密度為93%，所編碼的蛋白質(zhì)含53～2027個(gè)氨基酸不等。P32具有抗原特異性，P32是含有一個(gè)抗原決定簇，由319～324個(gè)氨基酸組成的囊膜蛋白，羧基端有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，對(duì)細(xì)胞有毒害作用。山羊痘病毒P32的結(jié)構(gòu)蛋白，具有免疫原性，免疫羊等動(dòng)物后可產(chǎn)生具有保護(hù)性的抗體，雖不能阻止病毒在攻毒部位的增殖，但可以阻止病毒向其他部位擴(kuò)散，減輕病羊的病理變化，可降低死亡率。國(guó)內(nèi)外學(xué)者還發(fā)現(xiàn)山羊痘病毒、綿羊痘病毒在P32基因上核苷酸和氨基酸水平上高度的同源，分別為97.5%和94.7%，兩者差異在綿羊痘病毒P32基因序列中第55位氨基酸是天冬氨酸，而山羊痘病毒中此位無(wú)此氨基酸。

目前，山羊痘的診斷主要依靠臨床經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷，國(guó)內(nèi)缺乏高效準(zhǔn)確的山羊痘病毒的檢測(cè)方法。為此，本研究用表達(dá)了山羊痘病毒P32蛋白作免疫抗原，構(gòu)建抗山羊痘病毒P32蛋白雜交瘤細(xì)胞，制備單克隆抗體，為進(jìn)一步建立山羊痘的檢測(cè)方法奠定工作基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株與菌株。山羊痘毒株（GTPV-S-1）、羊口瘡病毒株、鴿新城疫病毒株、雞減蛋綜合癥病毒株、S.enteritidis和E.coli由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存 ；山羊痘病毒P32蛋白抗原由本課題組提供。

1.1.2細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SP2/0細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；BALB/C小鼠（18～20g、6～8周齡、雌性），購(gòu)自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所小動(dòng)物室。

1.1.3主要試劑。新生牛血清（杭州四季青）；RPMI1640（GIBCO）；HAT、HT、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷、 氨基喋呤、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、羊抗小鼠IGg-HRP（Solarbio）；PEG1500（Merck）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（Sigma）。

1.2方法

1.2.1抗山羊痘病毒P32蛋白雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建

1.2.1.1小白鼠免疫。將純化的山羊痘病毒P32重組蛋白與弗氏佐劑等比例混合、乳化，分別免疫6～8周齡雌性BALB/C小白鼠6只。首免以弗氏完全佐劑乳化抗原，腹腔注射50 μg/只（0.2 mL）；二免，間隔15 d，用弗氏不完全佐劑乳化抗原免疫，腹腔注射50 μg/只（0.2 mL）；三免，間隔時(shí)間15 d，不加佐劑的P32重組蛋白作為免疫原，背部皮下分6點(diǎn)注射，每只100 μg（0.2 mL）；同時(shí)，從尾部尾靜脈采血，用間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清的抗體水平。小鼠血清效價(jià)達(dá)到1:4 000以上，該小鼠的脾細(xì)胞可作用于細(xì)胞融合。三免后第3 d可進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.1.2細(xì)胞融合。按常規(guī)方法，對(duì)免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，且小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的數(shù)量比為5：1。融合后的細(xì)胞分裝于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，置37 ℃5%CO2培養(yǎng)。每日觀察每孔的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并作好記錄。在融合后6～7 d，每孔移去HAT培養(yǎng)液0.1 mL，補(bǔ)加等量的HT培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.1.3篩選和克隆陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。待融合后的細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋細(xì)胞孔底部1/4～1/3時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，用間接ELISA方法檢測(cè)上清液中的抗體。同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照孔為免疫小鼠血清，陰性對(duì)照為SP2/0細(xì)胞上清和陰性小鼠血清，P/N≥2.0時(shí)判為陽(yáng)性。經(jīng)2次檢測(cè)為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞孔按有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。選擇OD492值高、細(xì)胞活力好的細(xì)胞孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存。

1.2.2抗山羊痘病毒P32蛋白單克隆抗體制備及鑒定。取10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟油進(jìn)行預(yù)處理。7 d后，小鼠腹腔注射生長(zhǎng)良好雜交瘤細(xì)胞，0.75×106個(gè)/只，收集腹水，測(cè)定抗體效價(jià)，分裝后置-80℃保存。特異性檢測(cè)：用間接ELISA方法測(cè)定與山羊痘病毒、羊口瘡病毒、鴿新城疫病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、S.enteritidis和E.coli交叉反應(yīng)性。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞融合與克隆

免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用化學(xué)融合劑PEG 1500進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)不斷改進(jìn)融合技術(shù)，細(xì)胞融合率達(dá)到90%以上，陽(yáng)性率為10%。將第1 次檢測(cè)到的10株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法克隆3次，經(jīng)檢測(cè)和篩選最終獲得4株能夠穩(wěn)定分泌抗GTPV-P32蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（1C9、1B11、3C8、3G9），隨著克隆代次增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體OD492值逐步升高，到第3次克隆時(shí)最終達(dá)到穩(wěn)定。

2.2單克隆抗體腹水的制備及抗體效價(jià)

滅菌液體石蠟油處理BALB/C小鼠，1周后分別接種4株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部膨大，用注射器無(wú)菌抽取腹水，以3 000 r/min離心20 min，收集上清，測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同雜交瘤細(xì)胞株在腹水和細(xì)胞培養(yǎng)液效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

由表1可知，雜交瘤細(xì)胞的腹水抗體效價(jià)在105以上，細(xì)胞培養(yǎng)液的效價(jià)為1:64。

2.3單抗特異性試驗(yàn)

用間接ELISA檢測(cè)單抗與其它病毒的交叉反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它只與山羊痘病毒P32重組蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與羊口瘡、鴿新城疫病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、S.enteritidis、E.coli都不發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明這4株單抗都是針對(duì)山羊痘病毒P32蛋白的，具有良好的特異性。

3　討論

山羊痘病毒P32基因位于基因組的64 kb～65 kb處，由第74 ORF編碼［1］，由319～324個(gè)氨基酸組成，含一個(gè)重要的抗原決定簇，具有跨膜結(jié)構(gòu)，跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（TM）位于C端287～307位氨基酸處。P32全長(zhǎng)基因?qū)?xì)胞有毒性作用，且在原核細(xì)胞中表達(dá)含量較低［2］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者試圖對(duì)P32基因截去跨膜區(qū)進(jìn)行表達(dá)，是否與完整的P32蛋白具有相同的抗原性和特異性。陳智華等人研究證實(shí)P32基因截去跨膜區(qū)后不影響其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的翻譯轉(zhuǎn)錄，能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而說(shuō)明截去跨膜區(qū)并未破壞P32蛋白抗原的決定簇［3］。我們所用的P32蛋白也是截去跨膜區(qū)后所表達(dá)的，經(jīng)免疫小鼠后能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這一點(diǎn)同陳智華等人的研究相符。

雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建環(huán)節(jié)多，稍不慎就前功盡棄，須細(xì)心對(duì)待每一環(huán)節(jié)。我們按常規(guī)方法構(gòu)建出了10株抗山羊痘病毒P32蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)測(cè)試從中篩選出4株特異、能產(chǎn)生效價(jià)較高的抗體雜交瘤細(xì)胞株為山羊痘檢測(cè)方法的建立創(chuàng)造了條件。

［1］Tulman E R，Afonso C L，Lu Z，et al. The genomes of sheep and goat pox viruses ［J］.Journal of virology，2002，76（12）：6054-6061.

［2］陳軼霞，鄭亞?wèn)|，竇永喜，等. 羊痘病毒P32蛋白基因的克隆與原核表達(dá)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（1）：31-34.

［3］陳智華，陳軼霞，劉俊林，等. 截去跨膜區(qū)對(duì)羊痘病毒P32基因免疫原性的影響［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009，28（4）：30-32.

（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Preparation of Monoclonal Antibodies against Goat Poxvirus P32 Protein

Chen Boxiang1，Yang Ming1，He Jiongjie2，Li Jie1
（1. Gansu Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Pingliang，Gansu 744000；2.Lanzhou Animal Husbandry and Veterinary Drug Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou，Gansu 730050）

The study was aimed to construct hybridoma cell line by using purified goat poxvirus P32 protein as immunogen for preparation of P32 protein monoclonal antibody. After BALB/C mice were immunized with purified P32 protein of goat poxvirus，cell fusion was carried out according to the routine method，resulting in 4 hybridoma cell lines，which could stably secrete P32 protein monoclonal antibody with good specificity. The ascites antibody titers were higher than 105. Construction of goat poxvirus P32 protein and preparation of monoclonal antibodies provided material for further research on the virus.

goat poxvirus；P32 protein；hybridoma cell；monoclonal antibody

S852.65+4

A

1005-944X（2015）12-0066-03

甘肅省科技支撐計(jì)劃（1104NKCL097）