林 杰，王旭榮，王 磊，張景艷，王學(xué)智，孟嘉仁，楊志強(qiáng)，李建喜

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荷斯坦奶牛乳腺組織凍存及乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)改進(jìn)

林 杰，王旭榮，王 磊，張景艷，王學(xué)智，孟嘉仁，楊志強(qiáng)*，李建喜*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州730050）

摘 要：為了改進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)和探究乳腺組織凍存方法，選用24月齡無(wú)泌乳史荷斯坦奶牛，采用組織塊種植法，通過(guò)側(cè)置和倒置兩種方式，分別從新鮮和凍存（8個(gè)月）的乳腺組織中分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞。結(jié)果表明，側(cè)置處理能使乳腺細(xì)胞爬出時(shí)間縮短1～2d，并改善組織塊貼壁速度和效果；回收于前次培養(yǎng)后的乳腺組織塊再分離培養(yǎng)，貼壁第2天即有乳腺上皮細(xì)胞爬出；一步冷凍（－80℃）液氮保存較大奶牛乳腺組織塊，凍存液A（FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1）凍存的組織塊存活率為50%，凍存液B（FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸鈉貯存液＝10∶7∶2∶1）凍存的組織塊存活率為56%。可見(jiàn)，作者建立的側(cè)置處理法和組織塊回收法可以用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)，可以縮短組織塊種植法實(shí)驗(yàn)周期，凍存液中加入緩沖液HEPES/丙酮酸鈉后有利于組織塊生物活性保持。

關(guān)鍵詞：乳腺上皮細(xì)胞；側(cè)置處理；組織凍存；原代培養(yǎng)；奶牛

體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞適宜建立細(xì)胞模型，是開展生理、病理、藥理等研究的重要實(shí)驗(yàn)材料。國(guó)外已有成熟永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，如MAC－T、BME－UV1［1－2］。國(guó)內(nèi)也有永生化奶牛乳腺細(xì)胞系研究的報(bào)道，如朱佳杰、李吉霞、上官陶、代瑞等通過(guò)轉(zhuǎn)染hTert、SV40T等獲得永生化乳腺上皮細(xì)胞［3－6］。但是，目前仍沒(méi)有成熟的商品化奶牛乳腺上皮細(xì)胞系，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室只能通過(guò)原代培養(yǎng)獲取奶牛乳腺上皮細(xì)胞。通常獲取原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法有以下4種：組織塊種植法、酶消化法、機(jī)械剪切法和乳汁分離法，其中以組織塊種植法和酶消化法最為常用。由于組織塊種植法培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，酶消化法和機(jī)械剪切法會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定損傷，乳汁分離法細(xì)胞得率較低，故需要不斷完善和改進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)。本研究對(duì)組織塊種植法分離乳腺上皮細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù)步驟進(jìn)行改進(jìn)，提出了側(cè)置處理法和組織塊回收培養(yǎng)法。該方法改善了組織塊種植法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞過(guò)程中的組織塊貼壁效果，縮短了試驗(yàn)周期。同時(shí)，為了解決用于細(xì)胞分離培養(yǎng)過(guò)程中奶牛乳腺組織獲取成本高的問(wèn)題，筆者對(duì)奶牛乳腺組織塊凍存技術(shù)進(jìn)行了探索，成功建立了凍存乳腺組織分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 24月齡健康荷斯坦奶牛，無(wú)泌乳史，購(gòu)自甘肅省荷斯坦奶牛繁育中心，運(yùn)送至蘭州海石灣屠宰場(chǎng)宰殺。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12（Gibco）、胎牛血清（FBS）（四季青）、青霉素鈉（160萬(wàn)單位）（哈藥集團(tuán)有限公司獸藥廠）、硫酸鏈霉素（100萬(wàn)單位）（浙江金力制藥有限公司）、兩性霉素B（Biosharp）、鼠尾膠原蛋白（gibco）、DMSO（Vetec）、角蛋白18單克隆抗體（Abcom）、FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG（Abcom）。

1.1.3 主要溶液 配制方法如下。

DMEM/F12培養(yǎng)液：pH為7.0～7.2，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。完全培養(yǎng)液：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液＋20%FBS＋500U·mL－1青霉素＋500 U·mL－1鏈霉素＋5μg·mL－1兩性霉素B。

D－Hank’s溶液：pH為7.0～7.2，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。應(yīng)用液：D－Hank’s溶液＋500 U·mL－1青霉素＋500U·mL－1鏈霉素＋5 μg·mL－1兩性霉素B。

胰酶消化液：準(zhǔn)確稱取20.0mg EDTA－2Na、250mg胰蛋白酶，D－Hank’s液溶解，定容至100 mL，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

凍存液A：按FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1比例配置（DMSO、DMEM/F12均用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌），現(xiàn)配現(xiàn)用。

凍存液B：FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸鈉貯存液＝10∶7∶2∶1比例配置（貯存液中HEPES 0.8mol·L－1、丙酮酸鈉0.02 mol·L－1，DMEM/F12、DMSO均用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌），現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERACELL 150i），倒置顯微鏡及相機(jī)（Nikon eclicse TS100－F；Nikon DS－U2；SAMSUNG WB150F），熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71DP72），掃描電鏡（JEOL JSM－6510）。

1.2 方法

1.2.1 乳腺組織取樣 試驗(yàn)?zāi)膛Ｍ涝缀螅榉勘砻嬗们逅浞譀_洗，75%酒精消毒，高壓滅菌解剖刀剖離整個(gè)乳房，置于75%酒精處理過(guò)的采樣箱中，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，再用75%酒精消毒組織表面，避開脂肪組織、結(jié)締組織和血管，剪取約2.5cm3的乳腺實(shí)質(zhì)，75%酒精浸泡3min后轉(zhuǎn)移入細(xì)胞間。

1.2.2 乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及純化 用DHank’s液浸洗組織4次以去除酒精，剔除外部泛白組織，將乳腺實(shí)質(zhì)剪碎至1mm3小塊。D－Hank’s液清洗后均勻接種于鋪滿鼠尾膠原蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別取不同培養(yǎng)瓶側(cè)置和倒置（圖1），培養(yǎng)箱中分別靜置30min和1h，吸除瓶底液體，緩慢加入完全培養(yǎng)液至剛好淹沒(méi)組織，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底后，移除組織塊，并將組織塊回收再接種培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時(shí)，差時(shí)胰酶消化法純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

圖1 培養(yǎng)瓶擺放方式Fig.1 Placement of cell culture flask

1.2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。掃描電鏡樣品制備如下：參照劉莉莉［7］方法制作細(xì)胞爬片，待細(xì)胞融合至70%～80%，D－Hank’s液清洗后用2.5%戊二醛4℃下固定1h；棄去戊二醛，D－Hank’s液和蒸餾水充分清洗后，依次用40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精逐級(jí)脫水，自然干燥后噴晶觀察。

1.2.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞鑒定 參照劉莉莉［7］試驗(yàn)方法制作細(xì)胞爬片。對(duì)角蛋白18進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，用PI染料核染，熒光顯微鏡下觀察［8］，鑒定上皮細(xì)胞并判斷其純度。

1.2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳代 當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時(shí)，胰酶消化，顯微鏡下觀察到多數(shù)細(xì)胞回縮、變圓、細(xì)胞間隙擴(kuò)大時(shí)，終止消化，反復(fù)吹打后，以1×105·mL－1細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)。

1.2.6 奶牛乳腺組織凍存 將乳腺實(shí)質(zhì)剪至約4～5mm3的小塊，每5mL凍存管中放入5～6塊組織，分別加入凍存液A和B。紗布包裹凍存管，于－80℃凍存24h后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

1.2.7 乳腺組織復(fù)蘇及細(xì)胞培養(yǎng) 8個(gè)月后凍存管37℃水浴快速解凍，D－Hank’s液充分清洗組織塊后，按照新鮮組織處理方法分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞。接種組織塊時(shí)每30塊為一組，每組3個(gè)重復(fù)，連續(xù)觀察10d，對(duì)有細(xì)胞爬出的組織塊進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算其平均值，比較A、B凍存液保存的奶牛乳腺組織爬出細(xì)胞的活力。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ橄俳M織脂肪含量較高（脂肪顆粒如圖2A所示），清洗小組織塊過(guò)程中易漂浮、接種后不易貼壁。相同時(shí)間內(nèi)側(cè)置處理組織貼壁效果優(yōu)于倒置處理組織，30min即可達(dá)到較好貼壁效果。側(cè)置處理的組織塊培養(yǎng)至第4～5天可見(jiàn)細(xì)胞爬出，倒置處理的組織塊培養(yǎng)至第6天可見(jiàn)細(xì)胞爬出。鵝卵石樣乳腺上皮細(xì)胞后于成纖維細(xì)胞爬出，兩者間有明顯界限（圖2A）；部分組織可直接爬出鵝卵石樣上皮細(xì)胞，無(wú)成纖維細(xì)胞爬出（圖3）?；厥盏慕M織接種后第2天即有細(xì)胞爬出，且鵝卵石樣細(xì)胞比例較高。

2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞純化

成纖維細(xì)胞消化30～60s，乳腺上皮細(xì)胞消化2～3.5min，純化2～3次即可得到較純的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。純化過(guò)程中，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行一次瓶?jī)?nèi)消化平鋪，可解決細(xì)胞團(tuán)塊中心部位密度過(guò)大的問(wèn)題（圖2B）。

2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

奶牛乳腺上皮細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，鵝卵石樣聚集，呈島嶼狀生長(zhǎng)，有少部分細(xì)胞呈多角型、攤雞蛋樣和梭形等，大小不一（圖4A），但其與成纖維細(xì)胞的形態(tài)差異極大（圖4C、D）。乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，細(xì)胞間可見(jiàn)上皮細(xì)胞特有的拉網(wǎng)結(jié)構(gòu)，存在接觸抑制現(xiàn)象。細(xì)胞傳至20代后，扁平圓餅狀極性細(xì)胞數(shù)量增多，也有三角形、長(zhǎng)形、多邊形極性細(xì)胞（圖4B）。

在掃面電鏡下細(xì)胞輪廓清晰，大小不一。鵝卵石樣乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核呈橢圓形，邊緣不光滑，攤雞蛋樣細(xì)胞中央有皺褶，表面較光滑，細(xì)胞體積較大（圖4E、F）。電鏡掃描下新鮮組織培養(yǎng)的上皮細(xì)胞和凍存組織培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)基本相同。

2.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定

用熒光標(biāo)記第5代乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18，熒光顯微鏡下可觀察到大量陽(yáng)性細(xì)胞，且其細(xì)胞核位置與細(xì)胞核染色位置基本重合，表明本研究成功獲得純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞（圖5A、B、C）。

圖2 細(xì)胞原代培養(yǎng)（Nikon，10×）Fig.2 Cell primary culture（Nikon，10×）

圖3 形態(tài)學(xué)觀察比較（10×）Fig.3 Comparison of morphology（10×）

2.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞穩(wěn)定性

側(cè)置與倒置處理得到的細(xì)胞生長(zhǎng)速度和形態(tài)學(xué)無(wú)明顯差異，傳至第10代的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度基本一致；20代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度雖無(wú)明顯變化，但形狀不規(guī)則的極化細(xì)胞逐漸增多（圖5D、E、F）。

2.6 凍存奶牛乳腺組織活性與培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察

分別取凍存液A和B中的組織塊進(jìn)行分離培養(yǎng)，每天爬出細(xì)胞的組織塊數(shù)見(jiàn)表1。來(lái)自于凍存液A的組織塊存活率為50%，來(lái)自凍存液B的組織塊存活率為56%。結(jié)果顯示凍存液B對(duì)組織塊的保存效果較好。

圖4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.4 The morphology of bovine mammary epithelial cell

圖5 免疫熒光鑒定角蛋白18（20×）Fig.5 The immunofluorescence assay of cytokeratin 18（20×）

表1 組織塊存活率Table 1 Survival rate of tissue piece 　塊·d－1

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，凍存組織在第4天有細(xì)胞爬出，且其與新鮮組織爬出的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別；部分組織塊也可直接爬出鵝卵石樣奶牛乳腺上皮細(xì)胞（圖3）。鑒定純化結(jié)果顯示，乳腺上皮細(xì)胞有角蛋白18表達(dá)。

3 討 論

3.1 組織材料的選擇

哺乳動(dòng)物乳腺腺泡通常到妊娠中晚期或泌乳期才能充分發(fā)育，泌乳后期又開始萎縮，是一個(gè)循環(huán)的組織重塑過(guò)程［9］。一般認(rèn)為，取自妊娠中晚期或泌乳期的乳腺組織較易獲得乳腺上皮細(xì)胞，因此利用健康的4～7歲泌乳高峰期或泌乳中后期的奶牛乳腺組織，培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞報(bào)道較多［1，10－12］。也有研究表明，非泌乳期乳腺組織也可用于乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。如M.Jedrzejczak等和G.Rauner等報(bào)道，利用小母牛乳腺組織分離、培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的效率高，獲得的原代細(xì)胞活性好［13－14］。本試驗(yàn)所選奶牛（24月齡）已達(dá)到性成熟，無(wú)泌乳史，可避免泌乳期乳腺組織初乳不易清洗的問(wèn)題，獲得的乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，可隔天傳代。試驗(yàn)結(jié)果提示，腺泡未得到充分發(fā)育的奶牛乳腺組織也可用于乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

3.2 組織材料的處理

細(xì)菌污染是困擾奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的主要問(wèn)題，其主要原因有兩方面：一是奶?；茧[性乳房炎，其乳腺組織帶菌，一般難控制、不易消除；二是人為污染。本研究通過(guò)三個(gè)環(huán)節(jié)克服以上問(wèn)題：（1）選擇無(wú)泌乳史奶牛，患隱性乳房炎概率極低，可以保證乳腺組織不帶菌；（2）注意無(wú)菌轉(zhuǎn)移，組織塊短時(shí)間浸于75%酒精中轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)，可保證組織表面無(wú)菌；（3）提高培養(yǎng)液和D－Hank’s中抗生素濃度，高于報(bào)道用量5倍，待細(xì)胞爬出后，再逐漸降低抗生素濃度，可保證組織塊處理和初期培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)可能存在細(xì)菌產(chǎn)生及時(shí)有效的抑制作用。

3.3 側(cè)置處理的優(yōu)勢(shì)

本試驗(yàn)中采用側(cè)置處理組織塊中乳腺上皮細(xì)胞爬出時(shí)間為4～5d，倒置處理組織塊中乳腺上皮細(xì)胞爬出時(shí)間為6～7d，側(cè)置比倒置縮短了1～2d。分析認(rèn)為，側(cè)置處理能夠盡快瀝干組織塊表面液體，這有利于組織塊的快速貼壁，能更好地保持組織活力。乳腺上皮細(xì)胞免疫熒光鑒定和傳代試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法得到的乳腺上皮細(xì)胞特異性角蛋白18表達(dá)水平和增殖效果基本一致?？梢?jiàn)，側(cè)置處理較常用的倒置［15］處理優(yōu)勢(shì)在于縮短組織塊種植法培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的周期。

3.4 形態(tài)學(xué)特征

據(jù)報(bào)道，體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞有3種類型：分泌上皮細(xì)胞、導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞。傳統(tǒng)的差速貼壁法和差時(shí)消化法很難將這3種上皮細(xì)胞分開，需要通過(guò)密度梯度離心的方法才能將其分開［16－17］。本試驗(yàn)熒光鑒定結(jié)果顯示，分離獲得的乳腺上皮細(xì)胞均能表達(dá)上皮細(xì)胞特有的角蛋白18，但其形態(tài)不一，推測(cè)可能有以上3種類型上皮細(xì)胞。掃描電鏡下分離到的乳腺上皮細(xì)胞呈鵝卵石樣，這與劉明江觀察到的結(jié)果［18］類似。但本試驗(yàn)觀察到的攤雞蛋樣乳腺上皮細(xì)胞還未見(jiàn)報(bào)道。

3.5 奶牛乳腺組織凍存法

組織凍存技術(shù)目前在遺傳育種、生物醫(yī)療領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，不僅可以保存稀缺組織，同時(shí)可以減少某些研究需要反復(fù)取材培養(yǎng)的麻煩。本研究采用凍存較大組織塊（4～5mm3）的方法保存奶牛乳腺組織，經(jīng)－80℃一步冷凍過(guò)夜后于液氮中保存8個(gè)月，凍存液A保存的乳腺組織成活率為50%，凍存液B保存的乳腺組織成活率為56%。本方法雖比孫蘇軍等［19］采用小組織塊（d＜0.3mm）和梯度凍存法保存的山羊乳腺組織塊復(fù)蘇后成活率（89.8%）低，但可大大簡(jiǎn)化組織塊剪切、清洗、凍存和復(fù)蘇等操作過(guò)程，且凍存液中加入緩沖液HEPES/丙酮酸鈉后有利于組織塊生物活性的保持，能夠滿足細(xì)胞分離培養(yǎng)的需要。

4 結(jié) 論

在利用組織塊種植法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞過(guò)程中，應(yīng)用側(cè)置處理法與組織塊回收法，從無(wú)泌乳史奶牛乳腺組織中成功分離培養(yǎng)出了奶牛乳腺上皮細(xì)胞；在乳腺組織凍存過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)凍存液中加入緩沖液HEPES/丙酮酸鈉后有利于組織塊生物活性的保持，采用一步凍存較大奶牛乳腺組織塊仍可保持其活性，能滿足乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)需要。

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（編輯 白永平）

Cryopreservation of the Mammary Gland and Improvement on the Culture of the Primary Epithelial Cells in Holstein Dairy Cows

LIN Jie，WANG Xu－rong，WANG Lei，ZHANG Jing－yan，WANG Xue－zhi，MENG Jia－ren，YANG Zhi－qiang*，LI Jian－xi*
（Engineering ＆Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS，Lanzhou730050，China）

Abstract：The present study was performed to improve the process of tissue explant method and explore the cryopreservation method of bovine mammary gland.The mammary epithelial cells were isolated and cultured from the fresh and cryopreserved（8mouths）mammary gland that collected from a 24months’Holstein dairy cow without history of lactation by tissue explant method including the side－place and inversion pattern respectively.Side－place method could shorten 1－2 days for appearance of cell，and improve the speed and adherence effect of tissue pieces，and the cells could climb out on the second day from the tissue pieces that were cultured and moved another flask.The survival rate was 50%for the tissue mass by liquid nitrogen storage followed by one－step cryopreservation（－80℃）with freeze－stored solution FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1while the survival rate was 56%with freeze－stored solution FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/sodium pyruvate＝10∶7∶2∶1.The side－place method and tissue pieces recycling method were established for mammary epithelial cells culture in the presented study，which couldshorten the cycle of tissue explant method.And the buffer HEPES/sodium pyruvate was benefit for maintaining the tissue bioactivity.

Key words：mammary epithelial cells；side－place method；tissue cryopreservation；primary cultural；dairy cow

中圖分類號(hào)：S858.237.26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－1067－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.027

收稿日期：2015－09－21

基金項(xiàng)目：國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS37）；公益性行業(yè)專項(xiàng)（20130304）

作者簡(jiǎn)介：林 杰（1991－），女，滿族，河北唐山人，碩士生，主要從事奶牛疾病研究，Tel：0931－2115262，E－mail：qielinjie2009@163.com

*通信作者：楊志強(qiáng)，研究員，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)與奶牛疾病防治研究，E－mail：zhiqyang2006@163.com；李建喜，研究員，主要從事獸醫(yī)藥理毒理與中獸醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用，E－mail：lzjianxil@163.com