林亞秋，廖紅海，賀慶華，李 倩，2，王 永，2*

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山羊FTO基因克隆及其表達(dá)譜

林亞秋1＃，廖紅海1，2＃，賀慶華1，李 倩1，2，王 永1，2*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041）

摘 要：本研究旨在闡明山羊FTO基因的表達(dá)特性，并分析其表達(dá)與肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)性。以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，采用RT－PCR方法克隆FTO基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)其組織表達(dá)差異，同時(shí)檢測(cè)該基因在不同發(fā)育階段不同部位山羊肌肉組織中的表達(dá)水平，并與IMF含量進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，山羊FTO基因CDS區(qū)為1 518bp，編碼505個(gè)氨基酸，為無跨膜結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。FTOmRNA在山羊的脂肪、脾和肺中表達(dá)水平較高（P＜0.01），在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)最低；FTO蛋白在背最長(zhǎng)肌和脾中表達(dá)較高（P＜0.01），脂肪組織中表達(dá)次之。同時(shí)結(jié)果顯示，F(xiàn)TOmRNA在24月齡山羊背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中表達(dá)水平顯著高于1～3 和8～10月齡的表達(dá)水平（P＜0.05）。FTOmRNA表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與股二頭肌及臂三頭肌IMF含量呈不同程度的正相關(guān)。本研究指出，F(xiàn)TO基因表達(dá)與IMF含量存在相關(guān)性，推測(cè)可作為IMF沉積的候選基因。

關(guān)鍵詞：山羊；FTO；克?。唤M織表達(dá)；肌內(nèi)脂肪含量

近年來，隨著人們消費(fèi)水平的提高及消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)的要求越來越高。山羊肉具有蛋白含量高，脂肪、膽固醇含量低，且含有多種人體必需氨基酸等優(yōu)點(diǎn)，因此備受人們推崇。我國(guó)是山羊養(yǎng)殖的大國(guó)，其分布地區(qū)廣，在我國(guó)畜牧業(yè)中占有非常重要的地位。肉用山羊是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)的主體，簡(jiǎn)州大耳羊是以努比山羊和簡(jiǎn)陽本地山羊?yàn)橛N材料培育出的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良地方肉用品種，因此闡明其優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制具有重要的理論與實(shí)際意義。

肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）是影響其肉質(zhì)性狀的一個(gè)極其重要的指標(biāo)，被認(rèn)為與肉質(zhì)呈正相關(guān)［1－2］，是山羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。IMF受多因素影響，其中從分子水平上闡明影響IMF的候選基因的調(diào)控作用是研究者所關(guān)注的焦點(diǎn)問題。脂肪肥胖相關(guān)基因（Fat mass and obesity associated gene，F(xiàn)TO）又叫FATSO，是2007年新發(fā)現(xiàn)的與人類肥胖相關(guān)的等位基因［3］，屬于非血紅色加雙氧酶基因超家族，編碼2－酮戊二酸依賴的核酸脫甲基酶。研究發(fā)現(xiàn)該基因廣泛存在于脊椎動(dòng)物中［4］，并在動(dòng)物多種組織中均表達(dá)，在食物攝入、能量代謝［5］、肥胖［3，6－7］和2型糖尿病［8－10］等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。關(guān)于FTO的研究比較深入的主要集中在人和鼠的能量平衡，基于該基因的重要性，畜牧工作者對(duì)該基因在動(dòng)物生產(chǎn)中的作用也非常重視，X.Jia等于2012年研究指出，雞FTO基因序列的多樣性與家禽的體重、肥胖等相關(guān)［11］，并且FTO基因的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）與豬、牛和兔子的肉質(zhì)性狀和生長(zhǎng)存在相關(guān)性，推測(cè)其可作為動(dòng)物肉質(zhì)和生長(zhǎng)的候選基因［1215］。但FTO基因在山羊上的研究目前尚未見相關(guān)報(bào)道，NCBI上僅見山羊FTO的預(yù)測(cè)序列，關(guān)于山羊FTO的基因特性，在山羊各組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)譜，及其是否可作為山羊肉質(zhì)性狀的候選基因皆需要通過試驗(yàn)來闡明。

因此本研究通過克隆得到山羊FTO基因，并對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting分析該基因在不同組織中的表達(dá)情況，并對(duì)該基因的時(shí)序表達(dá)情況及與肌肉中的IMF含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為進(jìn)一步研究山羊FTO基因功能及解析簡(jiǎn)州大耳羊優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與組織樣品采集 本試驗(yàn)選擇1～3月齡（羔羊）、8～10月齡（育成羊）和24月齡左右（成年羊）的簡(jiǎn)州大耳羊公羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物（每個(gè)階段各9只），購(gòu)自四川省簡(jiǎn)陽市。屠宰后迅速取其皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌組織；并同時(shí)采集成年公羊心、肝、脾、肺、腎、脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌等組織。采集的組織樣品用錫箔紙包好，置于液氮內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，－80℃放置備用。用于測(cè)定肌內(nèi)脂肪含量的樣品去除結(jié)締組織后帶回實(shí)驗(yàn)室置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Trizol、SYBR?Premix Ex Taq TM（2×）、pMD－19T載體購(gòu)自TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶和Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo公司，2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自Fermentas公司，膠回收試劑盒購(gòu)于Axygen公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生化科技有限公司，抗FTO多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcom公司，抗β－actin購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊FTO基因的克隆測(cè)序 按照Trizol試劑盒說明書操作步驟提取山羊皮下脂肪組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得總RNA的OD值為1.8～2.0，符合試驗(yàn)要求。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以O(shè)ligo（dT）為引物合成cDNA第一鏈。利用Primer Premier5.0軟件，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登陸的牛、牦牛及山羊預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（表1），產(chǎn)物長(zhǎng)度預(yù)計(jì)為1 731bp。PCR反應(yīng)體系為2×Long Taq PCR Master Mix 12.5μL、Primer F（10μmol·L－1）1.0μL、Primer R（10 μmol·L－1）1.0μL、DNA 1.0μL，ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃30s，57 ℃90s，72℃1min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用DNA回收試劑盒回收1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的目的條帶，然后連接于PMD－19T載體，轉(zhuǎn)化DH5α后篩選陽性克隆，最后送交生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 山羊FTO基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI的BLAST在線工具進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹；利用ExPASy分析推導(dǎo)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，利用ProtScale對(duì)山羊FTO蛋白疏水區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，利用SignalP 4.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列，利用NetPhos 2.0、NetOGlyc 3.1、NetNGlyc 1.0分析預(yù)測(cè)FTO蛋白磷酸化位點(diǎn)、O糖基化位點(diǎn)、N糖基化位點(diǎn)，通過PsortⅡ?qū)喖?xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)由STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)所構(gòu)建，Hopfield預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISSMODEL預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 山羊FTO基因組織表達(dá)譜 提取成年山羊的心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪等組織的總RNA（n＝6）和總蛋白（n＝3）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real－time PCR，qPCR）和Western blotting檢測(cè)FTO基因的組織表達(dá)差異。

qPCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq TM （2×）PCR 10μL，10μmol·L－1上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 8μL。PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性1min；95°C 30s，60℃/62℃30 s，45個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

Western blotting步驟：將上述提取的各個(gè)組織蛋白利用BradFord方法對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。提取的總蛋白100℃煮樣10min，12%SDS－PAGE分離蛋白，接著以200mA的電流將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉緩沖液封閉1h，用抗FTO和βactin的抗體（1∶1 000），室溫孵育2h。再與對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶2 000）室溫下孵育2h，最后利用Bio－Rad GS－800曝光系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白，并用Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.2.4 山羊FTO基因時(shí)序表達(dá)譜 分別提取1～3月齡、8～10月齡和24月齡左右的公羊皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌的總RNA（每個(gè)階段每個(gè)組織n＝9），并取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qPCR檢測(cè)FTO在3個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)差異。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.3。

1.2.5 IMF的測(cè)定 采用索氏抽提法測(cè)定1～3月齡、8～10月齡和24月齡左右的3個(gè)階段山羊背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌的IMF含量（每個(gè)階段公羊各9只），按照公式計(jì)算IMF含量：

式中，x表示浸提前樣品干重，y表示浸提后的樣品干重。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，組織差異定量分析結(jié)果以脂肪組織的Ct值為對(duì)照來計(jì)算，不同發(fā)育階段以1～3月齡為對(duì)照，結(jié)果用2－ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［16］。最終結(jié)果以SPSS 18.0軟件中的One－way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，基因的表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)用Bivariate Correlations的Pearson Correlation進(jìn)行分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著，當(dāng)P＜0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊FTO基因CDS擴(kuò)增及克隆測(cè)序

利用RT－PCR方法擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得與預(yù)期目的片段大小一致的特異條帶，經(jīng)過測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證獲得山羊FTO基因核苷酸序列1 731bp，其中5＇非翻譯區(qū)為34bp，3′非翻譯區(qū)為179bp，ORF為1 518bp，編碼505個(gè)氨基酸（圖1），將獲得序列提交GenBank（KR013052）。進(jìn)一步分析其堿基組成顯示A＝25.8%，C＝23.6%，G＝27.9%，T＝22.7%，X＝0.0%，（G＋C）＞（A＋T）%，說明該基因CDS區(qū)DNA雙鏈較穩(wěn)定。

2.2 物種間FTO同源性比較以及進(jìn)化樹構(gòu)建

本試驗(yàn)克隆得到的山羊FTO核苷酸序列與GenBank上登陸的山羊序列（XM＿005691984.1）比較有4個(gè)SNPs位點(diǎn)，即139位的C－T、865位的CG、1 105位的G－A和1 573位的A－G。利用NCBI在線比對(duì)程序BLAST將山羊FTO推測(cè)的氨基酸序列與綿羊、牛、印度水牛、馬、野駱駝、人、獼猴、豬和小鼠的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性較高，為82%～100%。同時(shí)利用各物種的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果顯示，F(xiàn)TO基因在各物種間具有較高的保守性，山羊FTO與反芻動(dòng)物在同一分支，親緣關(guān)系最近。

2.3 山羊FTO蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

2.3.1 FTO理化性質(zhì)分析 推測(cè)的山羊FTO蛋白序列經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白由505個(gè)氨基酸殘基組成，利用ExPASy在線工具對(duì)該蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析顯示，該蛋白分子式為C2609H4053N709O771S27，分子質(zhì)量為58.55ku，理論等電點(diǎn)為5.28，說明為酸性蛋白。原子總數(shù)為8 169，不穩(wěn)定系數(shù)為51.24，為不穩(wěn)定蛋白。帶負(fù)電荷的氨基殘基（Asp＋Glu）總數(shù)為79，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg＋Lys）總數(shù)為60，因此整體上帶負(fù)電。

2.3.2 FTO蛋白結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測(cè) 疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，山羊FTO蛋白在12位點(diǎn)處存在最小親水指數(shù)－3.222，在438位點(diǎn)存在最大親水指數(shù)2.000。疏水性平均值－0.523，為親水性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域分析顯示，山羊FTO蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)；信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號(hào)肽，為非分泌蛋白。蛋白修飾分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別位于56、183、229、256、319、355、358位點(diǎn)）、5個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別位于4、6、32、282、320）、5個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)（39、108、127、220、475），2個(gè)N－糖基化位點(diǎn)，無O－糖基化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，山羊FTO蛋白的35～326位氨基酸序列為FTO催化結(jié)構(gòu)域，329～500位氨基酸為C端結(jié)構(gòu)域（圖1、圖3）。亞細(xì)胞定位分析指出，F(xiàn)TO主要在細(xì)胞質(zhì)（73.9%）、細(xì)胞核（21.7%）和細(xì)胞骨架（4.3%）中發(fā)揮生物學(xué)作用。FTO二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，α－螺旋為208個(gè)，占41.19%，82個(gè)β折疊占16.24%，無規(guī)則卷曲215個(gè)占42.57%（圖4）。利用網(wǎng)上在線工具SWISSMODEL分析了該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5），進(jìn)一步證明了二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

2.3.3 FTO蛋白相互作用分析 利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)搜索山羊FTO蛋白相互作用蛋白（條件限制在10個(gè)蛋白內(nèi)），結(jié)果表明，F(xiàn)TO蛋白可能與MC4R、NPY、UCP1、CDKAL1等存在相互作用（圖6），通過這個(gè)分析可為更深入的研究山羊FTO蛋白的功能提供重要的支持。

2.4 山羊FTO基因的組織表達(dá)分析

qPCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因在山羊7個(gè)不同組織中均存在廣泛表達(dá)（圖7）。但FTOmRNA和蛋白表達(dá)存在不同，mRNA結(jié)果顯示，其中在山羊脂肪、脾和肺中存在高水平表達(dá)，極顯著高于其他各個(gè)組織（P＜0.01），其次在肝和腎中也存在較高水平的表達(dá)（P＜0.01），在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平最低。但FTO蛋白表達(dá)則在背最長(zhǎng)肌和脾中表達(dá)最高（P＜0.01），脂肪組織中表達(dá)次之，顯著高于肝和肺組織（P＜0.05）。

2.5 山羊FTO基因的時(shí)序表達(dá)分析

qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)TO基因在3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的脂肪和肌肉組織均被檢測(cè)到表達(dá)，其中在8～10月齡與24月齡的脂肪組織FTOmRNA表達(dá)水平顯著高于1～3月齡的表達(dá)水平（P＜0.05）；FTO mRNA在24月齡的背最長(zhǎng)肌和股二頭肌的表達(dá)水平顯著高于其他兩個(gè)階段的表達(dá)水平（P＜0.05），但在臂三頭肌的3個(gè)階段該基因表達(dá)水平均無顯著差異（P＞0.05）（圖8）。

圖1 山羊FTO核苷酸及其推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of goat FTO

圖2 不同物種間FTO基因的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of FTOof various species

圖3 山羊FTO推測(cè)的氨基酸序列生物學(xué)功能預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of biological function of the deduced amino acid sequence of goat FTO

圖4 FTO氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The predicted secondary structure of amino acid sequence of FTO

圖5 FTO氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 The predicted tertiary structure of amino acid sequence of FTO

圖6 山羊FTO蛋白與其他蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.6 The interaction network of goat FTO with other proteins

圖7 山羊FTO的組織分布Fig.7 Tissue distribution of goat FTO

圖8 FTO在不同發(fā)育階段山羊組織中的表達(dá)水平Fig.8 FTOmRNA expression in tissues of goat at different ages

2.6 山羊不同肌肉組織FTO mRNA表達(dá)與IMF含量的相關(guān)分析

不同部位肌肉IMF含量測(cè)定結(jié)果顯示（圖9），24月齡背最長(zhǎng)肌IMF含量顯著高于1～3月齡與8～10月齡的IMF含量（P＜0.05）；股二頭肌和臂三頭肌的3個(gè)階段IMF含量無顯著變化；且24月齡背最長(zhǎng)肌的IMF含量高于同階段的股二頭肌和臂三頭肌的IMF含量（P＜0.05）。山羊不同部位肌肉組織FTO基因表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)分析結(jié)果表明，F(xiàn)TO基因在山羊背最長(zhǎng)肌各個(gè)階段的表達(dá)水平與相對(duì)應(yīng)的IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為－0.415，與股二頭肌和臂三頭肌的IMF含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.014和0.093（表2）。

圖9 山羊不同肌肉部位肌內(nèi)脂肪含量的發(fā)育性變化Fig.9 IMF content developmental changes in muscles of different parts of goat

表2 山羊FTO基因的表達(dá)水平與IMF含量的相關(guān)性分析Table 2 The correlation of FTOgene expression and IMF content in muscles of different parts in goat

3 討 論

FTO基因最初由科學(xué)家1994年在腳趾融合的變異小鼠中發(fā)現(xiàn)［17］，并在1999年克隆得到該基因［18］，但前面對(duì)該基因一直未引起重視，直到2007年發(fā)現(xiàn)其與肥胖相關(guān)后才引起科研工作者（包括畜牧研究者）的廣泛關(guān)注。本研究首先克隆得到山羊FTO基因序列，發(fā)現(xiàn)其有4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，并未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，推測(cè)的氨基酸序列含有FTO特有的結(jié)構(gòu)域，并且該蛋白屬于無跨膜結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。該基因具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)糖基化位點(diǎn)，推測(cè)這些位點(diǎn)是調(diào)控山羊FTO蛋白功能的關(guān)鍵位點(diǎn)，這符合蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的修飾方式的說法［19－20］。同源性分析發(fā)現(xiàn)，山羊FTO氨基酸序列與綿羊、牛、馬、人、豬等動(dòng)物的同源性較高，且2－酮戊二酸的配基結(jié)合位點(diǎn)組氨酸（H231，H307）、天冬氨酸（D233）和精氨酸（R316，R322）完全一致，這與該基因具有高度保守性的報(bào)道相一致［21－23］。

為進(jìn)一步研究FTO基因在山羊肉質(zhì)中的作用，本研究檢測(cè)了該基因在山羊各個(gè)組織中的表達(dá)差異，獲得其組織表達(dá)譜。研究結(jié)果指出，F(xiàn)TO mRNA和蛋白在所選山羊7個(gè)組織中均存在廣泛表達(dá)，但其mRNA和蛋白表達(dá)水平在各個(gè)組織中存在差異。比如FTO mRNA在皮下脂肪、脾和肺中表達(dá)水平最高，在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)最低，但FTO蛋白在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)水平最高，其原因可能是由于該基因在肌肉組織中所轉(zhuǎn)錄的mRNA比較穩(wěn)定，降解速度慢，因此翻譯的蛋白質(zhì)比較多。FTO在山羊各個(gè)組織中的表達(dá)譜與其他動(dòng)物存在著一些相似及不同之處。如FTO基因在人、小鼠與大鼠的下丘腦中表達(dá)最豐富，調(diào)控食物攝入和能量平衡［2122，24］；Y.F.Wang等2012年發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在雞的下丘腦、肝、內(nèi)臟脂肪和小腦中高表達(dá)，說明其主要參與雞的能量調(diào)節(jié)［25］，并且A.Tiwari等指出，飼養(yǎng)條件的改變可以導(dǎo)致雞FTOmRNA和蛋白水平的變化［26］；M.B.Madsen等指出，F(xiàn)TO mRNA在哥廷根小型豬的肌肉、肝、腎、心等均檢測(cè)到了較高水平的表達(dá)，但還是在小腦中表達(dá)水平最高［27］；S.P.Sébert等在研究產(chǎn)前營(yíng)養(yǎng)和肥胖對(duì)綿羊FTO基因表達(dá)影響時(shí)候發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在1歲綿羊的下丘腦中表達(dá)最高，其次是肌肉，在胰腺和腎中表達(dá)水平最低［28］。綜上所述，F(xiàn)TO基因的組織表達(dá)譜具有物種和品種特異性，這也決定了該基因在各個(gè)物種中所發(fā)揮的主要作用不同。

由上述FTO基因的保守性及組織表達(dá)特性可以推測(cè)，該基因在進(jìn)化中可能有著重要調(diào)控作用，并且關(guān)于FTO基因在脂肪組織中的表達(dá)與肥胖的關(guān)系尤受人關(guān)注［29－30，7］，F(xiàn)TO的多態(tài)性是通過身體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）來介導(dǎo)肥胖的。研究指出，F(xiàn)TO基因突變小鼠（FTO－/－）和正常小鼠（FTO＋/＋）相比，當(dāng)敲除FTO基因后，脂肪含量顯著下降［31］。并且畜牧科研工作者在某些物種上發(fā)現(xiàn)FTO基因與動(dòng)物肉質(zhì)性狀有關(guān)，如Z.L.Hu等研究指出豬FTO基因位于背膘、平均日增重相關(guān)的QTL附近［32］，并且后續(xù)有試驗(yàn)證明豬FTO基因的c.594C＞G和g.276T＞G兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與肌內(nèi)和肌間脂肪沉積有關(guān)［33，12］。L.A.Rempel和S.J.Wei等分別報(bào)道FTO多態(tài)性與牛的體重及背最長(zhǎng)肌面積存在顯著相關(guān)［34，14］。G.W.Zhang等指出，兔FTOSNPs與生長(zhǎng)性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)［15］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因在山羊的3個(gè)典型發(fā)育階段（羔羊、育成羊和成年羊）的皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌4種組織中均存在表達(dá)，推測(cè)該基因的作用可能貫穿于山羊的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段。但該基因在不同肌肉中的表達(dá)模式不同，說明其表達(dá)具有部位特異性。為了闡明FTO基因是否與山羊肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)，同時(shí)對(duì)基因在不同部位肌肉中的表達(dá)水平與IMF含量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果指出，山羊FTO的基因表達(dá)與不同部位肌肉組織IMF含量均存在相關(guān)，且與背最長(zhǎng)肌中IMF含量相關(guān)達(dá)到顯著水平，推測(cè)其主要參與山羊背最長(zhǎng)肌的肌內(nèi)脂肪沉積。本研究數(shù)據(jù)提示，F(xiàn)TO可以作為山羊IMF沉積的候選基因，根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的FTO可能相互作用的蛋白質(zhì)來推測(cè)其作用機(jī)制可能是通過與MC4R、NPY和UCP1等與脂代謝相關(guān)蛋白的互作來實(shí)現(xiàn)的。研究指出，MC4R可作為肉牛肥育性狀及IMF相關(guān)的候選基因［35－36］，NPY的受體NPY2R多態(tài)性與BMI呈顯著相關(guān)［37］，UCP1基因的SNPs與人體脂沉積存在相關(guān)性［38］。并且S.Cauchi等2009年在肥胖中的研究指出FTO與MC4R基因的多態(tài)性對(duì)肥胖的影響具有聯(lián)合效應(yīng)［39］，與本試驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。但這幾個(gè)相關(guān)蛋白是如何與FTO進(jìn)行協(xié)同作用調(diào)控山羊IMF沉積的，其具體的作用機(jī)制則需要構(gòu)建山羊FTO表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，然后利用免疫共沉淀技術(shù)來做進(jìn)一步闡明。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到包含完整開放閱讀框的山羊FTO基因序列，該蛋白是分子量為58.55ku的不穩(wěn)定親水性酸性非分泌蛋白，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)具有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)糖基化位點(diǎn)，具有FTO典型的催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。高級(jí)結(jié)構(gòu)由α－螺旋、β－折疊和無規(guī)則卷曲組成。FTOmRNA和蛋白廣泛表達(dá)于各個(gè)組織中，其中mRNA水平在山羊的脂肪、脾和肺中存在高水平表達(dá)，在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最低；FTO蛋白表達(dá)水平在背最長(zhǎng)肌和脾中表達(dá)較高，脂肪組織中表達(dá)次之。不同發(fā)育階段山羊不同部位肌肉組織FTO mRNA表達(dá)水平與相應(yīng)的IMF含量呈不同程度的相關(guān)性。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究FTO基因在山羊脂肪沉積中的調(diào)控作用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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（編輯 郭云雁）

Cloning and Expression Profiling of FTOGene of Goat

LIN Ya－qiu1＃，LIAO Hong－h(huán)ai1，2＃，HE Qing－h(huán)ua1，LI Qian1，2，WANG Yong1，2*
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu610041，China；2.Key Laboratory of Sichuan Province for Qinghai－Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Exploitation，Chengdu610041，China）

Abstract：The aim of this study was to clarify the expression characteristics of FTOgene and investigate the correlation between FTOexpression and intramuscular fat（IMF）content in muscles.The FTOgene was cloned from Jianzhou Da’er goat by RT－PCR method.Quantitative Realtime PCR（qPCR）and Western blotting were used to measure the expression profiles of FTOgene in tissues，especially in various parts of muscle of goats at different developmental stages.The correlation analysis was performed between FTOgene and IMF content.The results showed that goat FTOgene was 1 518bp in CDS length，encoding 505amino acids.The FTO protein was predicted to be non－secretory and lacking cross－membrane domain.The mRNA level of FTO was higher in adipose，spleen and lung（P＜0.01），while lowest in longissimus dorsi；However，the protein level of FTO was higher in longissimus dorsi and spleen than that in adipose（P＜0.01）.The mRNA level of FTOwas significantly higher in longissimus dorsi and biceps femoris of 24－month－old goats than that in 1to 3－month－old and 8to 10－month－old goats（P＜0.05）.ThemRNA level of FTOwas negatively correlated with IMF content of longissimus dorsi（P＜0.05）but positively correlated with IMF content of biceps femoris and triceps brachii.In this study，we investigated a significant correlation between FTOexpression and IMF，which indicates that FTO may serve as a candidate gene for IMF.

Key words：goat；FTO；clone；tissue expression；intramuscular fat content

中圖分類號(hào)：S827；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－0888－11

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.005

收稿日期：2015－05－28

基金項(xiàng)目：四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目（2011NZ0099－36）；四川省科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)痉豆こ讨卮箜?xiàng)目（2014NZ0003）；四川省教育廳項(xiàng)目（15ZA0385）

作者簡(jiǎn)介：林亞秋（1976－），女，內(nèi)蒙古海拉爾人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E－mail：linyq1999@163.com；廖紅海（1988－），男，仡佬族，貴州正安人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E－mail：liaohonghaivip@163.com；林亞秋與廖紅海為并列第一作者

*通信作者：王 永，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E－mail：wangyong010101@swun.cn