趙一萍，張宇宏，李 蓓，黃金龍，白東義，趙啟南，烏尼爾夫，楊麗華，吳 敬，烏云達(dá)來(lái)，芒 來(lái)

?

兩個(gè)品種馬骨髓基因表達(dá)譜分析

趙一萍，張宇宏，李 蓓，黃金龍，白東義，趙啟南，烏尼爾夫，楊麗華，吳 敬，烏云達(dá)來(lái)，芒 來(lái)*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古馬遺傳資源保護(hù)及馬產(chǎn)業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

摘 要：為了尋找不同品種馬骨髓之間的差異表達(dá)基因，本研究構(gòu)建了蒙古馬－骨髓和純血馬－骨髓基因表達(dá)譜文庫(kù)，經(jīng)Illumina Miseq高通量測(cè)序，分別獲得了7 219 956和7 116 170個(gè)有效reads；兩個(gè)文庫(kù)映射到11、8和1號(hào)染色體的reads最多，而映射到29、30和31號(hào)染色體的reads最少；兩個(gè)文庫(kù)共篩出318個(gè)差異表達(dá)基因，其中與免疫相關(guān)的基因有21個(gè)。GO功能富集分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因與轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞質(zhì)等有關(guān)；KEGG通路富集分析結(jié)果表明，差異最大的顯著富集KEGG條目為神經(jīng)系統(tǒng)。這些結(jié)果為研究馬匹抗病力的遺傳和免疫機(jī)理等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬；骨髓；表達(dá)譜；差異基因

蒙古馬（Mongolian horse）是我國(guó)乃至世界著名的地方品種之一，具有抗病力強(qiáng)，持久力好，抗嚴(yán)寒、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)，能夠適應(yīng)惡劣的氣候及粗放的飼養(yǎng)條件，可以識(shí)別毒草而不中毒，除寄生蟲(chóng)病和外傷，很少發(fā)生內(nèi)科疾?。?］。蒙古馬具有的這些優(yōu)良性狀與其長(zhǎng)期生活的環(huán)境和遺傳因素有著直接的關(guān)系。對(duì)于某一性狀的研究，可以通過(guò)與此性狀相關(guān)的組織器官入手，研究與該性狀相關(guān)的候選基因或者篩選出與該性狀相關(guān)的基因［2－3］。

骨髓（Bone marrow）包括紅骨髓和黃骨髓，紅骨髓可以制造紅細(xì)胞、血小板和各種白細(xì)胞；血小板具有止血作用，白細(xì)胞能夠殺滅與抑制細(xì)菌、病毒等各種病原體。因此，骨髓對(duì)于維持機(jī)體正常的新陳代謝、生理生化功能和免疫力均非常重要。國(guó)內(nèi)外，對(duì)于骨髓在免疫功能方面的研究，通常是通過(guò)研究骨髓所產(chǎn)生的各種造血干細(xì)胞，以及與這些細(xì)胞有關(guān)的免疫因子。通過(guò)誘導(dǎo)、變性、損傷等方式，研究免疫應(yīng)答反應(yīng)以及相關(guān)元件的變化情況［4］。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，科學(xué)研究逐步進(jìn)入了基因組和后基因組時(shí)代［5］。高通量測(cè)序技術(shù)是DNA測(cè)序發(fā)展歷程的一個(gè)里程碑，為遺傳信息的揭示和基因表達(dá)調(diào)控等基礎(chǔ)生物學(xué)的研究提供了重要的數(shù)據(jù)信息［6］。對(duì)于馬匹采用高通量測(cè)序技術(shù)的報(bào)道多見(jiàn)于通過(guò)肌肉組織中基因的表達(dá)對(duì)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行研究［7－9］，在骨髓組織上未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)馬骨髓進(jìn)行基因表達(dá)分析，為研究馬匹抗病力的遺傳基礎(chǔ)和免疫機(jī)理等提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

蒙古馬長(zhǎng)期群牧飼養(yǎng)，能適應(yīng)惡劣的氣候及粗放的飼養(yǎng)條件；純血馬長(zhǎng)期處在高度人工飼養(yǎng)環(huán)境中，對(duì)環(huán)境條件要求較為嚴(yán)格，對(duì)惡劣環(huán)境條件的適應(yīng)性較差。本試驗(yàn)分別從內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市達(dá)茂旗、錫林浩特市鑲黃旗隨機(jī)選取3匹蒙古馬（公馬，幼駒）和從內(nèi)蒙古自治區(qū)馬業(yè)協(xié)會(huì)成吉思汗御馬苑（鄂爾多斯市伊金霍洛旗紅堿淖爾純種馬繁育基地）選取1匹純血馬（公馬，幼駒）進(jìn)行屠宰。屠宰過(guò)程中，立即采集骨髓組織，將新鮮的組織樣置于液氮中迅速冷凍，之后置于－80℃冰箱中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 總RNA提取和檢測(cè)

按照天根公司RNAprep pure Tissue Kit試劑盒提取骨髓總RNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取各組織樣品的總RNA質(zhì)量；用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD260nm/OD280nm值為1.8～2.1，說(shuō)明RNA樣品純度較好。

1.3 文庫(kù)制備和測(cè)序

通過(guò)mRNA純化并片段化，雙鏈cDNA合成，DNA雙末端修復(fù)，3′端引入“A”堿基，以及富集DNA片段等過(guò)程構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，使用Agilent 2100 對(duì)PCR富集片段進(jìn)行質(zhì)量控制，驗(yàn)證DNA文庫(kù)的片段大小及分布。對(duì)多樣品DNA文庫(kù)進(jìn)行均一化至10nmol·L－1后等體積混合。由上海派森諾生物科技有限公司提供測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

經(jīng)Illumina Miseq測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)（RawDate reads），對(duì)RawDate reads按照序列堿基平均質(zhì)量＞Q30，前50bp N＜1，總N＜3的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過(guò)濾得到Clean－Data reads。使用Bowtie/Tophat軟件將序列（reads）Map到馬的參考基因組上，確定reads在基因組各染色體上的分布情況。提取GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)中基因注釋，獲得每條基因在不同類型數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋信息。統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因Map到馬的參考基因組的reads數(shù)目并計(jì)算RPKM值（Reads per kilo bases per million reads），同時(shí)Map到馬的參考基因組的reads數(shù)據(jù)通過(guò)DESeq軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行差異表達(dá)及其顯著性（P－value/FDR）分析。

1.5 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證

參照GenBank中馬β－actin基因、UCHL1、LOC100065720、LOC100049872、CXCL10、LOC100053963、CCL3、DRB、C7基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0，同時(shí)結(jié)合Oligo 6.0軟件進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)特異的實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR（RT－qPCR）引物。所設(shè)計(jì)的引物序列片段大小如表1所示，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

蒙古馬與純血馬骨髓總RNA利用TaKaRa公司Prime Script RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。利用TaKaRa公司SYBR?Rremix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑在Agilent MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上采用SYBR greenⅠ熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。最佳反應(yīng)條件：95℃30s，X ℃30s，72℃20s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。X為退火溫度，退火溫度分別為60.0℃（β－actin、LOC100049872、C7基因）、62.0℃（UCHL1、LOC100065720、CXCL10、LOC100053963、CCL3基因）、56℃（DRB基因）。PCR過(guò)程中，陰性對(duì)照用1μL滅菌水代替cDNA樣品。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR反應(yīng)的特異性由熔解曲線判定，定量的結(jié)果是由Ct值計(jì)算得出，以β－actin基因作為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct定量分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

表1 馬β－actin基因和免疫相關(guān)基因RT－qPCR擴(kuò)增引物的序列Table 1 The primers for RT－qPCR of horseβ－actin and immune－related genes

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序文庫(kù)的建立

2.1.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè) 從蒙古馬與純血馬的骨髓組織中提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)28S和18SrRNA條帶清晰、完整、無(wú)降解（圖略）；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果：OD260nm/OD280nm值為1.8～2.1，OD260nm/OD230nm≥2.0，總RNA濃度不低于250ng·μL－1，樣品總量不低于50μg，電泳檢測(cè)28S∶18S＞1.2。以上檢測(cè)結(jié)果表明，RNA樣品無(wú)降解，濃度達(dá)到建庫(kù)要求。

2.1.2 cDNA文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)100bp Marker選擇需要的區(qū)域（200～400bp）；用凝膠回收試劑盒將所切的片段回收，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（圖略）。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)處理和分析

2.2.1 Map到基因組分析結(jié)果 本試驗(yàn)構(gòu)建了純血馬－骨髓和蒙古馬－骨髓2個(gè)表達(dá)譜文庫(kù)。經(jīng)Illumina Miseq測(cè)序，分別獲得原始數(shù)據(jù)197 909 140 bp和198 869 008bp。將這些原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，獲得CleanData數(shù)據(jù)分別為185 020 420bp和187 718 856bp；去除低質(zhì)量序列后，得到可供進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組拼接的序列reads數(shù)分別為7 116 170和7 219 956，分別占總reads數(shù)的93.49%和94.39%。數(shù)據(jù)過(guò)濾的結(jié)果為有效Reads＞90%，說(shuō)明樣品和測(cè)序質(zhì)量較高。2個(gè)文庫(kù)注釋為專一位置的reads數(shù)目分別為6 307 565條（91.33%）和6 342 209條（91.12%）；分別有4 166 758條和4 100 890條reads Map在基因組上，注釋率分別為60.34%和58.92%。2個(gè)文庫(kù)中Map在外顯子區(qū)的reads分別為51.61%和48.74%，Map在基因區(qū)間的reads分別為39.66%和41.08%（表2）。Map到基因上的reads約為60%，Map到外顯子上的reads數(shù)目約為50%，結(jié)果正常。

表2 馬骨髓表達(dá)譜文庫(kù)RNA測(cè)序信息Table 2 The RNA sequencing information of the expression profile libraries of horse－bone marrow

2.2.2 Map到染色體分析結(jié)果 高通量測(cè)序得到的數(shù)據(jù)映射到染色體上，所得結(jié)果如圖1所示。檢測(cè)的兩個(gè)文庫(kù)Map到第11、8和1號(hào)染色體的reads最多，而Map到第29、30和31號(hào)染色體的reads最少。這與兩個(gè)文庫(kù)Uniq Mapped Read數(shù)目的多少有一定關(guān)系。

圖1 馬骨髓表達(dá)譜文庫(kù)在染色體的分布Fig.1 The distribution of the expression profile libraries on chromosomes of horse－bone marrow tissues

2.3 基因表達(dá)譜分析

2.3.1 差異表達(dá)基因分析結(jié)果 對(duì)蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓表達(dá)譜文庫(kù)進(jìn)行比較，差異表達(dá)分析按照2－fold和P－value進(jìn)行判斷，對(duì)兩個(gè)文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值進(jìn)行分析，共篩出318個(gè)差異表達(dá)基因。與純血馬－骨髓相比較，蒙古馬－骨髓表達(dá)量顯著上調(diào)的基因有241個(gè)，表達(dá)量顯著下調(diào)的基因有77個(gè)，其中有21個(gè)差異表達(dá)基因與免疫相關(guān)（在蒙古馬－骨髓中上調(diào)的基因?yàn)?6個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)?個(gè)）（表3）。

表3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 The statistical results of differentially expressed genes

2.3.2 差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果 蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異基因GO功能分析，注釋到生物學(xué)過(guò)程（Biological process）類別中的差異表達(dá)基因有1 217個(gè)，注釋到細(xì)胞組分（Cellularcomponent）類別中的差異表達(dá)基因有869個(gè)，注釋到分子功能（Molecular function）類別中的差異表達(dá)基因有397個(gè)。在生物學(xué)過(guò)程類別中，生物學(xué)過(guò)程（Biological process）中的差異表達(dá)基因最多為136個(gè)，其次為轉(zhuǎn)運(yùn)（Transport）中的差異表達(dá)基因?yàn)?6個(gè)，在生物合成過(guò)程（Biosynthetic process）、細(xì)胞氮代謝過(guò)程（Cellular nitrogen compound metabolic process）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展（Anatomical structure development）中的差異表達(dá)基因分別為64、63、63和62個(gè)；在細(xì)胞組分類別中，細(xì)胞（Cell）中的差異表達(dá)基因最多為190個(gè)，其次胞內(nèi)（Intracellular）中的差異表達(dá)基因?yàn)?63個(gè)，在細(xì)胞器（Organelle）、細(xì)胞成分（Cellular component）、質(zhì)膜（Plasma membrane）中分別為133、115和108個(gè)差異表達(dá)基因；在分子功能類別中，歸類到分子功能（Molecular function）的差異表達(dá)基因最多為228個(gè)，其次離子結(jié)合（Ion binding）為104個(gè)差異表達(dá)基因（圖2）。

表4 蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異表達(dá)基因GO富集分析（通過(guò)GO富集檢驗(yàn)）Table 4 The Gene Ontology analysis of differentially expressed genes in Mongolian horse－bone marrow and Thoroughbred－bone marrow

兩個(gè)文庫(kù)通過(guò)GO富集檢驗(yàn)（P＜0.05）的差異表達(dá)基因所對(duì)應(yīng)的GO條目為顯著富集的GO條目，見(jiàn)表4。在生物學(xué)過(guò)程（Biological process）類別中，顯著富集的GO條目包括轉(zhuǎn)運(yùn)（Transport）、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)（Cell－cell signaling）、生物學(xué)過(guò)程（Biological process）、內(nèi)環(huán)境平衡過(guò)程（Homeostatic process）、小分子代謝過(guò)程（Small molecule metabolic process）、細(xì)胞形態(tài)（Cell morphogenesis）等；在細(xì)胞組分（Cellular component）類別中，包括細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、細(xì)胞成分（Cellular component）、細(xì)胞（Cell）、質(zhì)膜（Plasma membrane）等；在分子功能（Molecular function）類別中，包括離子結(jié)合（Ion binding）、分子功能（Molecular function）、結(jié)構(gòu)分子活性（Structural molecule activity）。然而，免疫系統(tǒng)過(guò)程并沒(méi)有通過(guò)GO富集檢驗(yàn)。

2.3.3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果 對(duì)蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，注釋到神經(jīng)系統(tǒng)（Nervous system）途徑的差異表達(dá)基因最多為40個(gè)，其次，注釋到傳染?。↖nfectious diseases）和消化系統(tǒng)（Digestive system）途徑的差異表達(dá)基因?yàn)?5和31個(gè)，但傳染病途徑?jīng)]有通過(guò)KEGG顯著富集分析，免疫系統(tǒng)也沒(méi)有通過(guò)KEGG顯著富集分析（表5）。差異最大的KEGG條目為消化系統(tǒng)。

表5 蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異表達(dá)基因KEGG富集分析Table 5 The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis of differentially expressed genes in Mongolian horse－bone marrow and Thoroughbred－bone marrow

2.3.4 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證 為了驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果，選取與免疫相關(guān)的8個(gè)基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行測(cè)定。從圖3可知，這些基因通過(guò)RT－qPCR驗(yàn)證得到的相對(duì)表達(dá)量和RNA測(cè)序得到的相對(duì)表達(dá)量的趨勢(shì)相同，采用高通量測(cè)序得到蒙古馬－骨髓中上調(diào)和下調(diào)基因在RT－qPCR中得到同樣的結(jié)果，說(shuō)明高通量測(cè)序的基因表達(dá)量是可靠的，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。

3 討 論

家馬（Domestic horse）的染色體為64條（2n）［9］，已公布馬匹的全基因組序列是一匹純血馬母馬［10］，所以，現(xiàn)可以獲得1～31號(hào)常染色體和X號(hào)染色體［11］。構(gòu)建的兩個(gè)文庫(kù)Map到染色體上的趨勢(shì)基本一致，均在11、8和1號(hào)染色體的reads較多，而29、30和31號(hào)染色體的reads比較少，這與馬匹每條染色體分布的基因數(shù)目趨勢(shì)基本相同。相比純血馬，蒙古馬在除8、11、26號(hào)和X染色體外，在其他染色體上Map的基因數(shù)都略比純血馬高，這可能是由于蒙古馬的Uniq Mapped Read比純血馬的要略微高些的緣故。另外，本試驗(yàn)獲得的一些基因Map不到染色體，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)選擇的馬匹都是公馬，而現(xiàn)在Y染色體上的基因信息沒(méi)有公布。

圖2 蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.2 The Gene Ontology analysis of differentially expressed genes in Mongolian horse－bone marrow and Thoroughbredbone marrow

圖3 免疫相關(guān)基因RNA測(cè)序和RT－qPCR相對(duì)表達(dá)量的比較Fig.3 The comparison of RNA sequencing and RT－qPCR relative expression for immune－related genes

本試驗(yàn)對(duì)構(gòu)建的兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行比較，共篩出318個(gè)差異表達(dá)基因；與純血馬－骨髓比較，蒙古馬－骨髓表達(dá)量顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因有241個(gè)，表達(dá)量顯著下調(diào)的差異表達(dá)基因有77個(gè)，其中有21個(gè)差異表達(dá)基因與免疫相關(guān)。不同品種相同組織之間是存在一定差異的，之前在不同品種雞的胸肌組織［12］、豬的脂肪組織［13］、豬的背最長(zhǎng)?。?4－15］等研究中也充分體現(xiàn)。

蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異表達(dá)基因GO功能分析，注釋到生物學(xué)過(guò)程類別中的差異表達(dá)基因最多，生物學(xué)過(guò)程、轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成過(guò)程、細(xì)胞氮代謝過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、小分子代謝、分解代謝過(guò)程、免疫系統(tǒng)過(guò)程等，差異基因在這些過(guò)程中表達(dá)說(shuō)明骨髓所行使的機(jī)能，活躍在細(xì)胞的分子代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，這一系列的生理生化過(guò)程對(duì)機(jī)體正常功能運(yùn)行起到了調(diào)控作用。差異基因在細(xì)胞功能類別中注釋的最少，包括分子功能、DNA結(jié)合、離子結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合等，這說(shuō)明在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，同一基因在不同生物體內(nèi)的作用是固定的。從顯著富集GO條目的程度來(lái)看，生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能均有條目通過(guò)GO富集檢驗(yàn)（P＜0.05），但是免疫系統(tǒng)并沒(méi)有通過(guò)GO富集檢驗(yàn)。這可能是因?yàn)榛虮磉_(dá)水平都是通過(guò)讀段計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)的，轉(zhuǎn)錄本較長(zhǎng)或表達(dá)水平較高的基因擁有更多的讀段，因此更容易被多數(shù)統(tǒng)計(jì)方法識(shí)別為差異表達(dá)基因［16］，這種偏好可能對(duì)后續(xù)分析帶來(lái)影響。以GO類別富集分析來(lái)說(shuō)，這種偏好將導(dǎo)致長(zhǎng)基因占主導(dǎo)功能的類別更容易被識(shí)別為富集的功能。另外，差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果顯示，很多通過(guò)富集檢驗(yàn)的GO條目均與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、小分子代謝、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)，而免疫應(yīng)答反應(yīng)也常常與這些功能有著直接或間接的聯(lián)系，因此可以側(cè)面反映蒙古馬與純血馬的骨髓在免疫方面的作用。

蒙古馬－骨髓與純血馬－骨髓差異基因KEGG富集分析，注釋到神經(jīng)系統(tǒng)的差異基因最多，其次為傳染病和消化系統(tǒng)。純血馬靈敏、易調(diào)教、性格溫順，對(duì)疾病的易感性高，而蒙古馬則表現(xiàn)為悍威強(qiáng)、不易馴服、耐寒耐粗飼抗病力強(qiáng)，而神經(jīng)系統(tǒng)與訓(xùn)練調(diào)教有密切的關(guān)系。由于純血馬是人工舍飼喂養(yǎng)，蒙古馬長(zhǎng)期處于粗獷的自然環(huán)境中，以牧草為生，飼料結(jié)構(gòu)隨著四季的變化而變化，因此不論是從生長(zhǎng)環(huán)境還是飼料結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，兩個(gè)品種馬均不相同，對(duì)疾病抵抗的能力和消化系統(tǒng)均存在差異。

4 結(jié) 論

本研究利用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)蒙古馬－骨髓和純血馬－骨髓基因表達(dá)譜文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序，分別獲得了7 219 956和7 116 170個(gè)有效reads。兩個(gè)文庫(kù)共篩出318個(gè)差異表達(dá)基因，其中有21個(gè)差異基因與免疫相關(guān)（在蒙古馬－骨髓中上調(diào)的基因有16個(gè)，下調(diào)的基因有5個(gè)）。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏窠?jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中有著重要的作用。高通量RNA－Seq提供了馬骨髓基因表達(dá)譜信息，為研究相關(guān)基因在骨髓中所起的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ 中國(guó)畜禽遺傳資源委員會(huì).中國(guó)畜禽遺傳資源志－馬驢駝志［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.Chinese Domestic Animal Genetic Resources Commit－tee.Animal genetic resources in China－h(huán)orse donkeys camels［M］.Beijing：China Agriculture Press，2011.（in Chinese）

［2］ YU K，SHU G，YUAN F，et al.Fatty acid and transcriptome profiling of longissimus dorsi muscles between pig breeds differing in meat quality［J］.Int J Biol Sci，2013，9（1）：108－118.

［3］ ZHAO S，HULSEGGE B，HARDERS F L，et al.Functional analysis of inter－individual transcriptome differential expression in pig longissimus muscle［J］.J Anim Breed Genet，2013，130（1）：72－78.

［4］ EZEH P C，LAUER F T，MACKENZIE D，et al.Arsenite selectively inhibits mouse bone marrow lymphoid progenitor cell development in vivo and in vitro and suppresses humoral immunity in vivo［J］.PLoS One，2014，9（4）：e93920.

［5］ PAN Q，SHAI O，LEE L J，et al.Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high－throughput sequencing［J］.Nat Genet，2008，40（12）：1413－1415.

［6］ 王興春，楊致榮，王 敏，等.高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用［J］.中國(guó)生物工程雜志，2012，32（1）：109－114.WANG X C，YANG Z R，WANG M，et al.Highthroughput sequencing technology and its application ［J］.China Biotechnology，2012，32（1）：109－114.（in Chinese）

［7］ PARK K D，PARK J，KO J，et al.Whole transcriptome analyses of six thoroughbred horses before and after exercise using RNA－Seq［J］.BMC Genomics，2012，13：473.

［8］ MCGIVNEY B A，MCGETTIGAN P A，BROWNE J A，et al.Characterization of the equine skeletal muscle transcriptome identifies novel functional responses to exercise training［J］.BMC Genomics，2010，11：398.

［9］ 芒 來(lái).馬在中國(guó)［M］.香港：香港文化出版社，2009.MANG L.Horse in China［M］.Hongkong：Hongkong Culture Press，2009.（in Chinese）

［10］ WADE C M，GIULOTTO E，SIGURDSSON S.Genome sequence，comparative analysis，and population genetics of the domestic horse［J］.Science，2009，326 （5954）：865－867.

［11］ 楊 虹，馬月輝，李 蓓，等.馬基因組研究進(jìn)展［J］.遺傳，2010，32（3）：211－218.YANG H，MA Y H，LI P，et al.Progress on horse genome project［J］.Hereditas，2010，32（3）：211－218.（in Chinese）

［12］ 劉武藝.兩個(gè)品種雞胸肌不同發(fā)育階段全基因組表達(dá)譜的系統(tǒng)分析［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.LIU W Y.Systematic analysis of the global gene expression profiles in breast muscle tissues of two chicken breeds at different developmental stages［D］.Beijing：China Agricultural University，2010.（in Chinese）

［13］ LI X J，YANG H，LI G X，et al.Transcriptome profile analysis of porcine adipose tissue by high－throughput sequencing［J］.Anim Genet，2012，43（2）：144－152.

［14］ 輝 錢.利用表達(dá)譜芯片技術(shù)研究中外豬種不同時(shí)期肌肉組織中的表達(dá)差異基因［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.HUI Q.Microarray analysis of skeletal muscle at four stages in yorkshire and meishan pigs［D］.Wuhan：Huazhong Agricultural University，2012.（in Chinese）

［15］ 張冬杰，劉 娣，汪 亮，等.民豬和大白豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（2）：181－187.ZHANG D J，LIU D，WANG L，et al.Screen and annotation of different expression genes in Min pig and Yorkshire pig Longissimus dorsi muscle［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2013，44（2）：181－187.（in Chinese）

［16］ OSHLACK A，WAKEFIELD M J.Transcript length bias in RNA－seq data confounds systems biology［J］.Biol Direct，2009，4：14.

（編輯 郭云雁）

Analysis of Gene Expression Profile of Bone Marrow in Two Horse Breeds

ZHAO Yi－ping，ZHANG Yu－h(huán)ong，LI Bei，HUANG Jin－long，BAI Dong－yi，ZHAO Qi－nan，SHIRAIGO Wunierfu，YANG Li－h(huán)ua，WU Jing，BAO Wuyundalai，DUGARJAVIIN Mang－lai*
（Inner Mongolia Mongolian Horse Genetic Resources Protection and Industrial Engineering Laboratory，College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Abstract：To investigate the differential genes expression of bone marrow between different horse breeds，expression profiling libraries of Mongolian Horse－bone marrow and Thoroughbred－bone marrow were constructed.We obtained 7 219 956and 7 116 170useful reads by the Illumina Miseq sequencing，respectively.The most of reads in the 2expression profiling libraries were maped on chromosome 11，chromosome 8and chromosome 1，and the least of reads were maped on chromosome 29，chromosome 30and chromosome 31.318differentially expressed genes were found in 2expression profiling libraries，including 21immune－related genes.The Gene Ontology analysis showed that the differentially expressed genes were related to transport，cell－cell signaling，biological process and cytoplasm，etc.The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis indicated that nervous system was the most differentiated KEGG term.These results will provide data basis for further studies on the horses disease resistance and immune mechanism.

Key words：horse；bone marrow；expression profiles；differential genes

中圖分類號(hào)：S821.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－0922－09

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.008

收稿日期：2015－05－04

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（20130902）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（20140172）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015BS0316）

作者簡(jiǎn)介：趙一萍（1984－），女，滿族，河北高碑店人，博士，助理研究員，主要從事馬遺傳育種與繁殖研究，E－mail：yipingzhao@imau.edu.cn

*通信作者：芒 來(lái)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事馬屬動(dòng)物種質(zhì)資源創(chuàng)新與遺傳改良研究，Tel：0471－4316151，E－mail：dmanglai@163.com