袁澤湖，王慧華，胡師金，朱才業(yè)，趙福平，張 莉，杜立新，魏彩虹

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利用50K芯片數(shù)據(jù)分析中國11個地方綿羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)

袁澤湖，王慧華，胡師金，朱才業(yè)，趙福平*，張 莉，杜立新，魏彩虹*

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

摘 要：旨在構(gòu)建我國綿羊群體遺傳結(jié)構(gòu)的精細圖譜，為我國綿羊遺傳資源的保存、利用提供依據(jù)。利用烏珠穆沁羊、湖羊、同羊、大尾寒羊、羅布羊、哈薩克羊、多浪羊、迪慶羊、青海臧羊、四川藏羊、西藏藏羊共計11個地方綿羊品種（資源）的Illumina Ovine SNP 50K芯片數(shù)據(jù)，應用NETVIEW、PCA、STRUCTURE、NJ樹等方法對群體結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明，烏珠穆沁羊與除羅布羊以外的蒙古系綿羊均有直接遺傳關(guān)系，與羅布羊有間接的遺傳關(guān)系。羅布羊與哈薩克系綿羊有較近的遺傳關(guān)系，而哈薩克系的哈薩克羊與多浪羊存在較遠的遺傳關(guān)系。迪慶羊能夠與藏系綿羊分離開，西藏地區(qū)藏羊能夠與其他地區(qū)的藏羊分開，青海、四川的藏羊不能分開。結(jié)果提示，NETVIEW計算時間短，且基本能夠反映史實，因而可以作為未來群體結(jié)構(gòu)分析的工具；烏珠穆沁羊是此次試驗選用的蒙古系綿羊中最古老的品種；蒙古系的羅布羊因混有哈薩克系綿羊的血統(tǒng)而與新疆地區(qū)的綿羊聚在一起；不同地區(qū)的藏羊存在著分化趨勢，但分化并不嚴重。

關(guān)鍵詞：綿羊；群體結(jié)構(gòu)；網(wǎng)絡(luò)視圖（NETVIEW）

我國具有悠久的養(yǎng)羊歷史和多種多樣的地理生態(tài)條件，因而擁有較為豐富的綿羊遺傳資源，僅《中國畜禽遺傳資源志·羊志》記載的我國綿羊地方品種或資源就達42個［1］，約占世界綿羊品種或資源的5%［2－3］。近年來，由于數(shù)量遺傳學理論的應用，人工授精、胚胎移植等生物技術(shù)的發(fā)展，專門化品種或品系的培育，國外高產(chǎn)品種的引進，我國綿羊生產(chǎn)取得了較大的遺傳進展。然而，綿羊的集約化生產(chǎn)在滿足商業(yè)化需求的同時，也使得遺傳資源不斷遺失。人工授精技術(shù)降低了對種公羊數(shù)目的需求，從而使得群體的有效群體大?。∟e）減少；高產(chǎn)品種的引進以及綿羊品種逐步單一化，使得地方品種所特有的環(huán)境適應性、抗病性等優(yōu)良品質(zhì)逐步喪失。因此，為保護生物多樣性、保存一些符合未來需求的遺傳資源、合理利用綿羊遺傳資源，對我國地方綿羊品種進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析是十分必要的。

我國綿羊的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析主要應用線粒體DNA（mtDNA）［4－8］和微衛(wèi)星標記［911］，并取得較大成績，如J.Guo等首次報道我國綿羊群體的mtDNA存在C類群［12］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和新方法的提出，尤其是綿羊商業(yè)化SNP芯片技術(shù)的成熟，獲得更精細的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖譜成為可能。J.W.Kijas等［13］2009年首次應用芯片數(shù)據(jù)對綿羊進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，2012年對全球主要綿羊品種進行了更加深入的分析［14］。A.Burren等［15］在2014年應用50K芯片數(shù)據(jù)和NETVIEW的方法構(gòu)建了瑞士綿羊的精細群體遺傳結(jié)構(gòu)圖譜。當前利用高密度芯片進行群體結(jié)構(gòu)分析的方法主要有主成成分分析（PCA）、STRUCURE分析、進化樹分析，而新的群體結(jié)構(gòu)分析方法網(wǎng)絡(luò)視圖（NETVIEW）［16］使用較少，該方法具有計算速度快、易用于高密度芯片數(shù)據(jù)、群體結(jié)構(gòu)圖譜“分辨率”高等優(yōu)點［16］。到目前為止，利用NETVIEW方法構(gòu)建我國綿羊群體遺傳結(jié)構(gòu)圖譜還鮮見報道。本研究應用NETVIEW和PCA、STRUCTURE、NJ樹等方法，利用50KSNP芯片數(shù)據(jù)，構(gòu)建我國綿羊群體遺傳結(jié)構(gòu)的精細圖譜，為我國綿羊遺傳資源的保存、利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用頸靜脈采血方法采集以下綿羊血液樣本：6只烏珠穆沁羊（UJU），9只胡羊（HUS），10只同羊（Tong），10只大尾寒羊（LTH），10只羅布羊（LOP），9哈薩克羊（KAZ），8只多浪羊（DUL），9只迪慶羊（DIQ），9只青海藏羊（TIBQ），10只四川藏羊（TIBS），21只西藏藏羊（TIB）。用EDTA抗凝，－20℃保存，用于基因組DNA提取。所有樣品均采自原產(chǎn)地保種場或保種核心區(qū)域。

1.2 基因型檢測

用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，提取的方法與步驟參照其說明書。用AstraGeneAstraNet核酸分析儀測定DNA濃度和純度，根據(jù)DNA芯片雜交平臺的要求，合格的DNA濃度須大于50ng·μL－1，OD260nm/OD280nm指標范圍在1.6～2.0，OD260nm/OD230nm指標范圍在1.8～2.1。為確保DNA的濃度，每個樣本DNA連續(xù)測定3次，取平均值，不合格的樣本需要濃縮或者重新提取DNA，直至樣本的濃度和純度都滿足后續(xù)分型試驗的要求。DNA樣品合格后，送博奧生物有限公司用Illumina Ovine SNP50K芯片進行分析獲得SNP分型數(shù)據(jù)，然后采用GenomeStudio軟件篩選數(shù)據(jù)并對SNP等位基因頻率進行分析，剔除未定位的SNPs位點，用PLINK軟件［17］進行質(zhì)量控制。質(zhì)量控制的標準是：檢出率大于0.9，最小等位基因頻率大于0.01，哈迪溫伯格平衡P值大于0.000 001。

1.3 聚類分析

在聚類分析之前，用Plink軟件［17］的indeppairwise選項刪除連鎖緊密的SNPs位點（參數(shù)設(shè)置為：窗口值為25個SNPs，一個步長為5個SNPs，R2的閾值設(shè)置為0.05），產(chǎn)生20 632個獨立的SNPs標記。主成分分析（PCA）使用R語言的snpstats包［18］進行。利用STRUCTURE 2.3.4軟件［19］構(gòu)建群體結(jié)構(gòu)：113個綿羊個體進行K＝2～10的分析（每個K值重復3次），馬爾科夫蒙特卡洛（MCMC）計算的參數(shù)burn－in設(shè)為10 000，重復值設(shè)為20 000；結(jié)果文件的數(shù)據(jù)整合用CLUMPP 1.1.2軟件［20］；結(jié)果的可視化使用DISTRUCT 1.1軟件［21］。

1.4 NETVIEW分析

用NETVIEW方法構(gòu)建“高分比率”的群體結(jié)構(gòu)圖譜，NETVIEW方法包含以下幾個步驟：1）用Plink軟件對芯片數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，質(zhì)控標準同1.2；2）計算個體間的親緣關(guān)系或遺傳距離矩陣，常用的遺傳距離有Wright’s FST［22］、Nei’s標準遺傳距離［23］、等位基因共享距離（Allele sharing distance，ASD）［24］等，此次研究采用ASD作為遺傳距離；3）用超順磁聚類方法［25］（Super paramagnetic clustering，SPC）構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，SPC方法用SPIN軟件實現(xiàn)［26］。此次試驗中，最近鄰數(shù)（kNN）的最大值設(shè)置為10，最小值設(shè)置為2；4）將個體聚類到各個群體網(wǎng)絡(luò)；5）結(jié)果的可視化用Cytoscape軟件［27］，Cyoscape所用的數(shù)據(jù)格式用NEAT在線軟件［28］轉(zhuǎn)換。

1.5 NJ樹分析

利用GENEPOP 4.2.2軟件［29］計算群體之間的兩兩FST值，然后基于FST/（1－FST）公式計算兩兩FST矩陣，用于R語言ape包［30］構(gòu)建群體NJ樹和個體NJ樹。

2 結(jié) 果

2.1 PCA分析

為了研究中國地方綿羊品種之間的遺傳結(jié)構(gòu)，首先進行主成分分析（PCA），主成成分基于個體之間的遺傳相關(guān)（共享IBS片段）代表群體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，前兩個主成分（PCA1、PCA2）分別占總變異的3.1%和2.0%。人和牛的研究表明，主成分分析能將地理起源的不同個體分開［31－32］。如圖1所示，根據(jù)PCA1，可將我國的地方綿羊分為兩組：藏系（PCA1＞0）和蒙古哈薩克系（PCA1＜0）。結(jié)合前兩個主成分（PCA1和PCA2），發(fā)現(xiàn)3個藏系品種（資源）（DIQ、TIBQ、TIBS）聚集在一起，而與西藏藏羊分開。5個蒙古系品種（UJU、HUS、TON、LTH和LOP）也聚集在一起。然而，兩個哈薩克系品種（DUL和KAZ）卻有著明顯分離，且哈薩克羊與蒙古系羊存在一定程度的混合。

2.2 SRTUCTURE分析

為了觀察中國地方綿羊群體的分離程度，利用STRUCTURE軟件估計11個品種之間共同祖先的比例。結(jié)果表明，當K＝2時，我國的地方綿羊品種分為兩個類群，一類是藏系綿羊，以紅色背景為主；另一類是蒙古系和哈薩克系以藍色背景為主，這與PCA的結(jié)果一致。隨著K值的增加，一些綿羊品種（資源）發(fā)生分離。在K＝3時，多浪羊從蒙古系哈薩克系綿羊中分離出來，與PCA的結(jié)果一致。在K＝4時，迪慶羊從藏系綿羊中分離出來。當K＝5時，大尾寒羊開始分離。K＝6時，哈薩克羊開始分離。K＝7時，湖羊開始分離。K＝8～11時，羅布羊、同羊逐步從群體中分離。而無論K為何值，烏珠穆沁羊和藏羊不存在明顯的分化（圖2）。

2.3 NETVIEW分析

利用NETVIEW方法［33］構(gòu)建我國綿羊群體的群體結(jié)構(gòu)圖。結(jié)果表明，我國的綿羊群體主要分為兩個遺傳背景（圖3），藏系（TIB，TIBS，TIBQ，DIQ）和哈薩克蒙古系（KAZ、DUL、LOP、UJU、LTH、HUS、TON），這與PCA分析的結(jié)果一致。迪慶羊能夠從藏系綿羊分離出來，而藏羊（TIB，TIBS，TIBQ）個體之間存在錯綜復雜的關(guān)系，且存在較為復雜的亞群結(jié)構(gòu)。羅布羊與哈薩克系羊有著較為密切的血緣關(guān)系，其他的蒙古系綿羊能夠單獨分離出來，哈薩克羊與蒙古系綿羊的烏珠穆沁羊有較近的親緣關(guān)系。

2.4 NJ分析

計算11個群體之間有成對的FST值并調(diào)整為FST/（1－FST）（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有群體之間四川藏羊和青海藏羊之間的分化程度最低（0.012），而在迪慶羊和多浪羊觀察到的FST差異最大（0.086）。在蒙古系綿羊群體之間，羅布羊和烏珠穆沁羊的FST最低（0.013 6）?；谌后w間的FST值，NJ樹結(jié)果（圖4B）顯示，迪慶、四川藏羊、青海藏羊、西藏藏羊在一個主要分支中，這個結(jié)果支持傳統(tǒng)的分類，均為藏系綿羊。在NJ樹的另一端主要的血統(tǒng)包括蒙古族和哈薩克族。此外，3個品種（多浪羊、羅布羊、哈薩克羊）聚集在同一分支，這3個品種均來自新疆地區(qū)。個體間的NJ樹結(jié)果表明，3個新疆地區(qū)的綿羊（哈薩克羊、羅布羊、多浪羊）、除羅布羊外的蒙古系綿羊、藏系綿羊均能相鄰的聚在一起，而青海藏羊則被另外的藏羊分開。

圖1 利用前兩個主成分（PC）對試驗個體進行聚類的散點圖Fig.1 Scatter plot of animals clustered on the basis of principal component（PC）analysis using individual genotypes

圖2 11個中國綿羊品種K＝2～10時STRUCTURE結(jié)果Fig.2 Population structure of 11sheep breeds inferred by STRUCTURE results from K＝2－10

圖3 中國綿羊NETVIEW群體結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Population structure of 11sheep breeds inferred by NETVIEW

表1 11個中國地方綿羊品種（資源）之間的兩兩FSTTable 1 Pairwise FSTamong 11Chinese indigenous breeds（resources）

圖4 中國綿羊的NJ樹Fig.4 Neighbor－Joining（NJ）phylogeny for Chinese indigenous sheep breeds

3 討 論

根據(jù)地理分布和遺傳關(guān)系，我國的家養(yǎng)綿羊可劃分為3大譜系：藏系綿羊（Tibetan group）、蒙古系綿羊（Mogolian group）、哈薩克系綿羊（Kazak group）。一些研究結(jié)果顯示中國綿羊至少存在3個母系起源［12，34－37］。另一些研究認為我國的綿羊有2個母系起源［3839］。本研究應用PCA、STRUCTURE、NETVIEW和NJ樹進行遺傳結(jié)構(gòu)分析。PCA是一種經(jīng)典的非參數(shù)線性降維方法，這一方法通過主成分去揭示群體結(jié)構(gòu)。它在全基因組關(guān)聯(lián)分析中常用于校正群體分層［40－41］。然而，PCA并不能確定群體分類的個數(shù)，因而在使用PCA時，通常與標準的分類方法聯(lián)用。此次試驗中，結(jié)合PCA和NJ樹可以將11個地方綿羊群體分為2組，NETVIEW得到類似的結(jié)果，一種基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析方法—STRUCTURE廣泛用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析［42］，在此次試驗中，芯片的密度相對較高，群體的個數(shù)較多，這一方法的計算時間很長，因而當芯片密度更高時，STRUCTURE就不太適合了。此次STRUCTURE分析的結(jié)果表明當K＝2時，這些群體的分組與NETVIEW類似。這幾種方法得到了幾乎一致的結(jié)論，由此可以認為這11個地方綿羊群體由2個遺傳背景組成：一個是蒙古－哈薩克系，另一個是藏系，這與傳統(tǒng)的分為3大系譜不同，更傾向于支持2個母系起源，但仍需要擴大樣本范圍做進一步的分析。

蒙古系綿羊由于良好的適應性和優(yōu)良的生產(chǎn)性能并且在元代時曾跟隨成吉思汗遠征［43］，因而在我國分布最廣泛，主要分布在內(nèi)蒙古、中原和東部沿海地區(qū)。廖信軍等［44］用微衛(wèi)星標記對67只綿羊進行研究后認為，洼地綿羊、小尾寒羊、灘羊聚為一類，湖羊和同羊聚為一類。張麗娟等［45］總結(jié)前人的研究結(jié)果認為，烏珠穆沁羊是蒙古羊中分化最晚的一支。NETVIEW的結(jié)果表明，烏珠穆沁羊與同羊、胡羊、大尾寒羊均有直接的親緣關(guān)系，雖然烏珠穆沁羊與羅布羊沒有直接的親緣關(guān)系，但烏珠穆沁羊通過57號多浪羊與羅布羊具有關(guān)系，且烏珠穆沁羊是與羅布羊具有最近親緣關(guān)系的蒙古系羊。群體間的NJ樹同樣也表明烏珠穆沁是距羅布羊最近的蒙古系綿羊，根據(jù)FST的結(jié)果，烏珠穆沁羊具有最小的平均兩兩FST值，STRUCTURE的結(jié)果顯示烏珠穆沁羊并不存在明顯的分離。此外，烏珠穆沁羊生活的地理位置更接蒙古羊的發(fā)源地－元朝的首都蒙古［43］，因此可以認為烏珠穆沁羊是這幾個蒙古系綿羊品種中最古老的蒙古系品種，這與張麗娟等［45］的觀點一致。

在新疆地區(qū)具有豐富的物種多樣性，這主要是和它的地理位置有關(guān)。新疆位于中亞和中原之間，在“絲綢之路”中是唯一必經(jīng)的地方［46］，其南部和北部地區(qū)的地理隔離也是其豐富多樣的一個原因。湯存?zhèn)サ壤梦⑿l(wèi)星的研究結(jié)果表明，多浪羊與哈薩克羊的親緣關(guān)系較遠［47］。在這項研究中，多浪羊和哈薩克羊來自新疆地區(qū)，它們之間具有中等程度的分化（成對FST＝0.069），與PCA和STRUCTURE的結(jié)果類似，NETVIEW的結(jié)果也表明多浪羊和哈薩克羊沒有直接的親緣關(guān)系，這與湯存?zhèn)サ龋?7］的結(jié)果一致。一個原因是，天山山脈將新疆分為南部和北部地區(qū)，多浪羊來自南部地區(qū)而哈薩克羊則來自北部地區(qū)。多浪和哈薩克之間的存在一定的地理隔離。還有另一種解釋，根據(jù)記錄多浪羊混有阿富汗羊的遺傳背景［48］，這也可能是導致這一現(xiàn)象的原因。在PCA和個體NJ樹中羅布羊的所有個體均能聚集在一起，但在PCA中羅布羊與哈薩克羊仍然存在混合，NETVIEW的結(jié)果顯示，蒙古系的羅布羊具有較為復雜的遺傳背景，群體NJ樹的結(jié)果表明羅布羊、多浪羊、哈薩克羊聚集在NJ樹的一個分支，而羅布羊?qū)儆诿晒畔稻d羊。有史料記載，公元1219年，蒙古族隨成吉思汗西征歐洲，途經(jīng)羅布泊地區(qū)，帶入了許多蒙古羊，蒙古族東歸時又帶回少數(shù)歐洲、俄國綿羊，經(jīng)過自然選擇和人工選擇，而形成了羅布羊［1］；二是建國初期當?shù)剡M行了綿羊改良，這種改良計劃使得羅布羊混雜了其他品種的血統(tǒng)［49］，因而，NETVIEW的結(jié)果較能反映出這種史實。

藏羊分布在西藏、青海、云南、甘肅、四川等地，楊曉軍等通過對基因組DNA進行RAPD分析認為藏羊具有明顯的品種間遺傳分化，可認為藏羊有幾個不同的品種［50］。但從NETVIEW的結(jié)果來看，不同地區(qū)的藏羊并沒有想象中的分化那么嚴重，而是存在相互交錯的親緣關(guān)系；PCA的結(jié)果能將西藏地區(qū)的藏羊和四川、青海地區(qū)的藏羊分開，但并不能將四川、青海地區(qū)的藏羊分開，這兩地藏羊群體間的FST值最小，也表明這兩地的藏羊分化較小；STRUCTURE的結(jié)果也表明，藏羊的遺傳背景相似；綜合來看，不同地區(qū)的藏羊雖然分化不嚴重，但不同地區(qū)的藏羊存在著亞群結(jié)構(gòu)，暗示不同地區(qū)的藏羊存在分化的趨勢。NETVIEW的結(jié)果表明，迪慶羊能夠從從藏系綿羊中分離出來，STRUCTURE、NJ樹分析有類似的結(jié)果，PCA不能將迪慶羊從藏系綿羊中分離出來，一個可能的原因是迪慶羊與藏羊同屬藏系羊，他們之間本身存在著較近的親緣關(guān)系［51］，當群體之間存在較近的親緣關(guān)系時，PCA的“分辨率”就不高［52］，因而不能識別這種微妙的群體結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本研究應用NETVIEW、PCA、STRUCTURE、NJ樹等方法對我國11個地方綿羊品種（資源）進行群體結(jié)構(gòu)分析，當群體中有較近的親緣關(guān)系時，PCA 和NJ樹的“分辨率”不高。STRUCTURE的計算時間過長，NETVIEW計算時間短，且基本能夠反映史實，因而可以作為未來群體結(jié)構(gòu)分析的工具。本研究結(jié)果提示，烏珠穆沁羊是本試驗選用的蒙古系綿羊中最古老的品種；蒙古系的羅布羊因混有哈薩克系綿羊的血統(tǒng)而與新疆地區(qū)的綿羊聚在一起；不同地區(qū)的藏羊存在著分化趨勢，但分化并不嚴重。本研究所選用的地方綿羊群體較少，樣本個數(shù)較少，為了得到更為準確、全面的結(jié)論，將來的研究應該加入更多的群體和個體。

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（編輯 郭云雁）

Population Structure Analysis of Chinese Indigenous Sheep by 50KChip Data

YUAN Ze－h(huán)u，WANG Hui－h(huán)ua，HU Shi－jin，ZHU Cai－ye，ZHAO Fu－ping*，ZHANG Li，DU Li－xin，WEI Cai－h(huán)ong*
（Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

Abstract：The study aimed to construct the fine－scale profile for population structure of Chinese indigenous sheep breeds，which would provide the basis for the conservation and utilization of germplasm of sheep.NETVIEW，PCA，STRUCTURE and NJ tree were used to analyze the Illumina Ovine SNP 50Kchip data from 11sheep breeds（resources）including Ujumqin sheep，Hu sheep，Tong sheep，Large Tailed Han sheep，Lop sheep，Kazakh sheep，Duolang sheep，Diqing sheep，Tibetan sheep from Qinghai，Tibetan sheep from Sichuan and Tibetan from Tibet.The results showed the indirect genetic relationship between Lop sheep and Ujumqin sheep and the direct genetic relationship between Ujumqin sheep and all Mongolia group sheep breeds except for Lop sheep.Lop sheep and Kazakh group sheep breeds had closer genetic relationship，Kazakh sheep and Duolang sheep existed a certain degree of differentiation.Diqing sheep could separate from Tibetan group.Tibetan sheep from Tibet could separate from the other regions of the Tibetan sheep，Tibetan sheep from Qinghai and Sichuan couldn’t be separated.The results suggest that NETVIEW calculate efficiently and can reflect basic historical facts，thus it can be used as the toolfor population structure analysis in the future；Ujumqin sheep is one of the oldest breeds of Mongolia group sheep breeds in this experiment；Lop sheep and other breeds from Xinjiang cluster together due to mixed lineage；There exist differentiation tendency in different regions of Tibetan sheep，but the differentiation is not serious.

Key words：sheep；population structure；NETVIEW

中圖分類號：S826；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0899－10

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.006

收稿日期：2015－07－01

基金項目：優(yōu)質(zhì)肉、毛羊新品種（系）選育與關(guān)鍵技術(shù)研究及示范項目（2011BAD28B05－2）；國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－39－04B）

作者簡介：袁澤湖（1988－），男，重慶綦江人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E－mail：yuanzehu＿caas@163.com；王慧華（1984－），男，江蘇東臺人，博士，主要從事動物遺傳育種研究，E－mail：wangyang＿4@hotmail.com。二者為并列第一作者

*通信作者：趙福平，副研究員，E－mail：zhaofuping@caas.cn；魏彩虹，女，副研究員，E－mail：weicaihong@caas.cn。二者并列為通信作者