劉濤華， 王顏顏， 牟麗麗， 呂　倩， 陳　燕， 張榮慶， 康穎倩*

(貴州醫(yī)科大學 微生物學教研室， 貴州 貴陽　550004)

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11株臨床諾卡菌16S rRNA及藥敏分析*

劉濤華**， 王顏顏， 牟麗麗， 呂倩， 陳燕， 張榮慶， 康穎倩***

(貴州醫(yī)科大學 微生物學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討應用11株臨床諾卡菌16S rRNA序列鑒定該菌菌種名，同時觀察該菌的藥敏情況。方法： 將11株臨床分離的諾卡菌菌株分別接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，觀察其生長情況；提取菌株DNA，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增其16S rRNA序列，并測定其基因序列，所獲序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對，鑒別其菌種名；采用Kirby-Bauey紙片擴散法檢測11株菌株藥敏情況。結果： 11株臨床諾卡菌在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速；PCR擴增菌株16S rRNA基因序列經(jīng)BLAST 比對，結果與GenBank中已知的諾卡.菌同源性>98%，分離的菌株分別為Nocardia otitidiscaviarum 4株、Nocardia cyriacigeorgica 3株、Nocrdia wallacei1株及Nocardia farcinica3株；藥敏實驗結果顯示11株諾卡菌均對阿米卡星敏感，對亞胺培南耐藥，其中Nocardia cyriacigeorgica對氨芐西林、環(huán)丙沙星、克拉霉素及阿莫西林的藥物敏感性結果與其它菌株截然不同。結論： 測定16S rRNA序列能夠快速、簡便、準確地鑒定諾卡菌菌種，各菌株均對阿米卡星敏感，對亞胺培南耐藥。

[關鍵詞]諾卡菌； 放線菌； 16S rRNA； 聚合酶鏈式反應； 序列分析； DNA； 藥敏試驗

諾卡菌(Nocardia)為需氧菌，廣泛存在于土壤、海水 、淡水及塵埃中，屬放線菌目,棒狀桿菌亞目,諾卡菌科,諾卡菌屬，其中對人致病的主要是星形諾卡菌，其次是巴西諾卡菌[1]。星形諾卡菌主要經(jīng)呼吸道或傷口感染人體，可引起肺部化膿性炎癥及壞死，或引起皮下慢性化膿性肉芽腫[2]。尤其在獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、腫瘤及其他免疫力低下者，易通過血行播散引起腦膜炎、腦膿腫等嚴重并發(fā)癥[3]。部分致病的諾卡菌感染人體后引起的臨床癥狀與結核分枝桿菌或非結核分枝桿菌感染的臨床癥狀相似，容易造成誤診[4]，因此快速、準確的鑒定諾卡菌尤為重要。本研究通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增11株諾卡菌16S rRNA序列并測定其序列，鑒定諾卡菌菌種名，同時，初步探討被測的諾卡菌藥物敏感情況。

1材料與方法

1.1菌株來源

研究所用的11株諾卡菌來源于上海4株，江蘇3株，北京、廣東、河南和湖北各1株，所致疾病和患者年齡見表1。

表1　11株諾卡菌菌株的基本情況

1.2菌株分離培養(yǎng)

將收集到的11株諾卡菌接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48～72 h，劃線法分離單菌落，挑取單個菌落傳代培養(yǎng)。

1.316S rRNA基因擴增、測序及BLAST比對

微波法提取菌株DNA[5]，進行PCR擴增。引物使用細菌16S rRNA擴增，通用引物27 f序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492 r序列為GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程股份有限公司合成。擴增體系為2×PCR Mix 13 μL， ddH2O 10 μL，上游引物、下游引物和模板DNA各1 μL，MgCl21 μL[6]。循環(huán)條件為：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性30 s、59℃退火50 s、72 ℃延伸90 s(35個循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取PCR產(chǎn)物，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果。PCR產(chǎn)物由立菲生物技術有限公司進行DNA序列測定，將所獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST 比對，比對結果按 16S rRNA 基因序列相似性大于97%的菌株歸于同一物種[7]。

1.4藥敏試驗

采用Kirby-Bauey紙片擴散法進行藥物敏感性試驗，操作和結果判讀標準參照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)制訂的標準(表2)：將所有菌株分別傳于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，菌液濃度為0.5麥氏濁度，分光光度值在0.08～0.10，調好濁度的菌懸液15 min內均勻涂布Mueller-Hinton agar plate(MH)平板。放置5 min，無菌鑷子貼相應的藥敏紙片，保持紙片間距大于40 mm，28 ℃培養(yǎng)48 h觀察培養(yǎng)板中抑菌圈生長情況并記錄結果[8-9]。

表2　藥片含量和敏感判斷標準

2結果

2.116S rRNA序列分析

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR擴增片段大小為1 400 bp(見圖1)。將16S rRNA序列測序結果(圖2)與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對(圖3)，鑒定菌種，所收集到的11株菌株與GenBank中已知的諾卡菌同源性>98%，屬于同一菌種。分離的菌株分別為Nocardiaotitidiscaviarum(GZ01、NJ01、SH01和SH02)，Nocardiacyriacigeorgica(NJ03、HB01和HN01)，Nocrdiawallacei(SH04)，Nocardiafarcinica(BJ01、NJ02和SH03)。

2.2藥敏實驗

結果顯示，各菌株均對阿米卡星敏感，對亞胺培南耐藥，其中Nocardiacyriacigeorgica對氨芐西林、環(huán)丙沙星、克拉霉素及阿莫西林的藥物敏感性結果與其它菌株截然不同。見表3。

注：M為Marker，1～11為收集的諾卡菌圖1　諾卡菌16S rRNA基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Agarose gel electrophoresis of amplification product of 16S rRNA gene

圖2　SH04菌株16S rRNA序列測定Fig.2　Sequence detection of 16S rRNA gene of SH04

圖3　SH04菌株BLAST比對結果Fig.3　BLAST comparison results of SH04

抗生素 菌種名稱NocardiaotitidiscaviarumNocardiacyriacigeorgicaNocardiafarcinicaNocardiawallacei氨芐西林耐藥敏感耐藥耐藥環(huán)丙沙星敏感耐藥敏感敏感卡那霉素敏感中度敏感敏感亞胺培南耐藥耐藥耐藥耐藥克拉霉素敏感耐藥中度敏感阿莫西林耐藥敏感耐藥耐藥阿米卡星敏感敏感敏感敏感慶大霉素敏感敏感耐藥耐藥紅霉素 中度耐藥耐藥耐藥四環(huán)素 中度中度敏感耐藥

3討論

諾卡菌所致疾病可發(fā)生于任何種族、職業(yè)及年齡的人群，且臨床癥狀復雜多樣，主要引起肺部、皮膚感染及急慢性化膿性或肉芽腫性病變，嚴重時甚至導致患者死亡。對人致病的主要是外源性感染星形諾卡菌，其次是巴西諾卡菌。星形諾卡菌主要經(jīng)呼吸道或傷口感染人體，可引起肺部化膿性炎癥及壞死，癥狀與肺結核相似。本研究所收集到的臨床放線菌主要來自北京、上海、廣東等醫(yī)學水平較高的地區(qū)，一方面是由于諾卡菌感染并不常見，多發(fā)生在免疫功能障礙或合并其他進行性疾病的患者；另一方面則是由于國內醫(yī)生對諾卡菌感染還沒有得到充分重視，其引起的感染不易與肺結核、肺膿腫、真菌感染相互區(qū)分。因此尋找一種快速，準確的鑒定方法尤為重要。病原菌鑒定有多種方法，如形態(tài)學觀察、血清分型、生化分析、遺傳學分析等。遺傳學分析法又包括基因序列分析、核酸分子雜交及分子標記檢測等。16S rRNA基因在基因序列分析中應用最多[10]。

本研究通過PCR方法擴增國內分離的11株臨床表形鑒定為諾卡菌屬菌株的16S rRNA序列并與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，所測定序列與已知的諾卡菌同源性>98%，歸于同一菌種。比對結果顯示分離的菌株分別為Nocardia otitidiscaviarum(GZ01、NJ01、SH01和SH02)，Nocardia cyriacigeorgica(NJ03、HB01和HN01)，Nocrdia wallacei(SH04)，Nocardia farcinica(BJ01、NJ02和SH03)。其中Nocardiaotitidiscaviarum一般引起腦膿腫及肺部感染[11]。相比于其他諾卡菌，該種引起感染相當罕見。藥敏結果顯示該菌耐氨芐西林、亞胺培南及阿莫西林等β-內酰胺類抗生素，對慶大霉素、阿米卡星等氨基糖苷類抗生素敏感，與文獻報道的相符[12]。本研究中共收集到3株Nocardiacyriacigeorgica，分別來自南京、湖北、河南，均引起肺部感染。藥敏結果顯示該菌對慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林和氨芐西林敏感，對卡那霉素和四環(huán)素中度敏感，對紅霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南和克拉霉素耐藥，與文獻報道的相符[13]。Nocardiawallacei為臨床條件致病菌，可通過吸入或直接皮膚進入機體。其對磺胺類藥物耐藥[14]。藥敏結果顯示該菌對阿米卡星、卡那霉素、環(huán)丙沙星和克拉霉素敏感，對慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、阿莫西林、亞胺培南和氨芐西林耐藥。Nocardiafarcinica是一種罕見的病原體，曾分離自蜂窩組織炎患者，主要影響免疫功能低下的患者[15]，可引起局部性或播散性的感染，若沒有及時的診斷和適當?shù)奶幚磉€可能會危及病人的生命。此菌耐大多數(shù)β-內酰胺類抗生素，對阿米卡星、亞胺培南、甲氧咔啶磺胺甲惡唑、第三代頭孢素以及氟喹諾酮類耐藥[16]。

綜上，測定16S rRNA序列能夠快速、簡便、準確地鑒定諾卡菌，各菌株均對阿米卡星敏感，對亞胺培南耐藥。

4參考文獻

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(2015-11-30收稿，2016-02-05修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Identification and Drug Susceptibility Test of 11 ClinicalNocardiaStrains

LIU Taohua， WANG Yanyan， MOU Lili， LYU Qian， CHEN Yan， ZHANG Rongqing， KANG Yingqian

(DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the characteristics and susceptibility of the Nocardia by molecular genotyping method. Methods: Eleven clinical strains were inoculated in Brain Heart Infusion Agar medium separately and growth condition was observed. DNA was extracted and sequenced by PCR. Tested sequence was compared with GenBank Database by BLAST and identified its species name. The drug susceptibility of 11 strains was tested by Kirby-Bauev method. Results: The strains grew rapidly in Brain Heart Infusion Agar medium. The DNA homology of 16S rRNA genes compared with the Nocardia strain known in GenBank were higher than 98% repectively. The collected clinical strains were Nocardia otitidiscaviarum (4 strains), Nocardia cyriacigeorgica (3 strains), Nocardia wallacei (1 strain) and Nocardia farcinica (3 strains). All these strains were sensitive to amikacin and resistant to imipenem. Of which, Nocardia cyriacigeorgica demonstrated complete different drug susceptibility from other strains against ampicillin, ciprofloxacin, clarithromycin and amoxicillin.Conclusion: DNA sequencing analysis is a fast, simple, and accurate way to identify Nocardia. Tested strains are susceptible to amikacin and resistant to imipenem.

[Key words]Nocardia; actinomyces; 16S rRNA; polymerase chain reaction; sequence analysis ; DNA; drug susceptibility test

[中圖分類號]R378； R519

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0268-04

*[基金項目]國家自然基金地方項目(31060006，31260029); 貴州省社會發(fā)展科技攻關項目[黔科合SY字(2011)3017號]； 貴州省衛(wèi)生廳科技項目(gzwkj2010-1-025)； 貴陽市科技局社會發(fā)展與民生計劃(筑科合同[2011103]16號)

**貴州醫(yī)科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:joycekangtokyo@qq.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-17網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1042.036.html