嚴(yán)會(huì)文， 蘇　敏， 高　杰， 廖文萍， 閆麗麗， 黃　悅*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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大鼠PAX6基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定*

嚴(yán)會(huì)文**， 蘇敏， 高杰， 廖文萍， 閆麗麗， 黃悅***

(貴州醫(yī)科大學(xué) 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因及PAX6基因的重組真核表達(dá)載體，觀察其在人胚腎細(xì)胞(293FT)細(xì)胞中的表達(dá)。方法： 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從大鼠腦組織中獲取PAX6基因，經(jīng)連接T載體測(cè)序驗(yàn)證正確后，與真核表達(dá)載體pEF1α-IRES-AcGFP經(jīng)SalI/BamHI雙酶切后；經(jīng)T4 DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP，用菌液PCR、SalI/BamHI雙酶切及測(cè)序鑒定正確后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，采用倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)、蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)PAX6蛋白表達(dá)。結(jié)果： 重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP經(jīng)RT-PCR和雙酶切均得到大小為1 269 bp的目的條帶，測(cè)序鑒定該序列與GenBank中大鼠PAX6基因序列的同源性達(dá)100%，插入基因的大小和方向正確；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后可見GFP綠色熒光，Western blot顯示PAX6蛋白表達(dá)。結(jié)論： 成功構(gòu)建了PAX6真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP，能在293FT細(xì)胞中表達(dá)PAX6蛋白。

[關(guān)鍵詞]綠色熒光蛋白； PAX6基因； 表達(dá)載體，真核； 脂質(zhì)體； 轉(zhuǎn)染

角膜盲是最重要的致盲眼病之一，全球約有超過(guò)1 000萬(wàn)的角膜盲患者，我國(guó)現(xiàn)有角膜盲患者約300多萬(wàn)，每年新發(fā)的感染性角膜病致盲患者約10萬(wàn)人[1]。然而，角膜供體的極度匱乏，是造成角膜盲得不到及時(shí)治療的主要原因之一。位于角鞏膜交界處的角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells, LSCs)是角膜上皮細(xì)胞自我更新、修復(fù)及再生的基礎(chǔ)，能夠修復(fù)并替代衰老死亡的角膜上皮細(xì)胞，在角膜上皮的更新和角膜疾病的治療中起著不可替代的作用[1-2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)人類與嚙齒類動(dòng)物的PAX6基因整個(gè)編碼區(qū)域相似性為100%， WNT7A和PAX6是LSCs分化的關(guān)鍵因子，p63和PAX6協(xié)同作用可促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的定向分化[3]。為L(zhǎng)SCs移植應(yīng)用于治療角膜盲等角膜疾病提供了研究方向。本課題通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體pEF1α- PAX6-IRES-AcGFP的方法，觀察PAX6在人胚腎細(xì)胞293FT中的表達(dá)，為PAX6在誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞分化的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

體質(zhì)量100～120 g的健康清潔級(jí)SD大鼠(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。人胚腎細(xì)胞293FT細(xì)胞(貴州醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞中心細(xì)胞庫(kù))、真核表達(dá)載體pEF1α-IRES-AcGFP(美國(guó)康涅狄格大學(xué)Lai Laijun教授惠贈(zèng))， pUCm-T Vector(上海生工生物工程有限公司)；Trizol?Reagent、脂質(zhì)體Lipofectamine?2000(Invitrogen公司，美國(guó))；限制性內(nèi)切酶SalI 和BamHI(New England Biolabs公司，美國(guó))，割膠回收試劑盒、質(zhì)粒小抽試劑盒(天根生化科技有限公司，中國(guó)北京)，T4 DNA Ligase(Takala，日本)，氨芐霉素、卡那霉素、SDS-PAGE試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，中國(guó)北京)，高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、內(nèi)參β-actin(上海生工生物工程有限公司，中國(guó)上海)，DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó))，胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司，中國(guó)杭州)，兔多克隆PAX6抗體、驢抗兔二抗(abcam，美國(guó))；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國(guó))，高速冷凍離心機(jī)、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀(Eppendorf，德國(guó))，PCR儀(ABI，美國(guó))；熒光倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2方法

1.2.1PAX6基因的擴(kuò)增和驗(yàn)證根據(jù)GenBank提供的已知序列(GeneID:18508)，對(duì)PAX6基因全CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物：上游引物5′-ATCAGAGTCGACATGCAGAACAGTCACAGCGGAG-3′，下游引物5′-ATCTGAGGATCCTTACTGTAATCGAGGCCAGTACTG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。取健康清潔級(jí)SD大鼠5只，無(wú)菌條件下由枕骨或第1頸椎處入路，用止血鉗將顱頂向上撬開，暴露腦組織，將腦組織冰上勻漿，參照Trizol Total RNA說(shuō)明書，采用一步法提取SD大鼠腦組織中的總RNA后再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PAX6基因PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：2×Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，補(bǔ)雙蒸餾水(ddH2O)至20 μL。循環(huán)條件為： 95 ℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min(35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物，采用0.7%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并割膠回收目的片段。參照T載體試劑盒說(shuō)明，將回收純化的PCR產(chǎn)物連接于pUCm-T Vector中，取5 μL連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，將轉(zhuǎn)化的菌液涂在含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)16 h。待LB平板長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落接種到5 mL LB的液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約12 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，用質(zhì)粒小量回收試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)菌液PCR鑒定和限制性內(nèi)切酶SalI 和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定正確后，將正確的細(xì)菌陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序并驗(yàn)證。

1.2.2真核表達(dá)質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP的構(gòu)建將連有PAX6基因并測(cè)序正確的pUCm-PAX6-T Vector和真核質(zhì)粒pEF1α-IRES-AcGFP分別用限制性內(nèi)切酶SalI和BamHI對(duì)其進(jìn)行雙酶切，回收1 269 bp的純化基因片段和酶切后線性化pEF1α-IRES-AcGFP質(zhì)粒DNA，用T4 DNA連接酶將目的基因片段PAX6定向插入帶綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因的哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pEF1α-IRES-AcGFP中。將5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至自制大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min，42 ℃熱沖擊90 s，冰上放置5 min，加入200 μL無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)45 min，取菌液200 μL涂布于含50 mg/L的卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，限制性內(nèi)切酶SalI /BamHI雙酶切鑒定，將初步篩選的陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3293FT細(xì)胞培養(yǎng)和重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞于37 ℃，5% CO2條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿傳代，轉(zhuǎn)染前24 h，以5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板；待細(xì)胞融合>95%時(shí)，按Lipofectamine?2000說(shuō)明書要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)立未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEF1α-IRES-AcGFP的293FT細(xì)胞做陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染4 h后更換普通培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后于倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)(綠色熒光)并拍照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4PAX6蛋白表達(dá)采用Western blot 法，收集轉(zhuǎn)染后24 h的各組293FT細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白并用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量；取蛋白20 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，采用轉(zhuǎn)移電泳裝置，于500 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)封閉PVDF膜4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次， 10 min/次；用封閉液稀釋的兔多克隆抗體PAX6(1∶1 000)與封閉好的PVDF膜室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次。室溫下用封閉液稀釋的二抗抗體(1∶5 000)與封閉好的PVDF膜室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次，用ECL試劑盒曝光獲得顯示條帶的膠片，掃描圖像保存，用β-actin(1∶8 000)作內(nèi)參照驗(yàn)證蛋白含量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1大鼠PAX6基因cDNA的克隆

大鼠PAX6基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1 269 bp處可見特異性條帶，結(jié)果見圖1。目的片段克隆入pUCm-T Vector和測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI/BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，符合率為100%(見圖2)。

注：M為DNA Marker V，泳道1為PAX6基因片段，泳道2為陰性對(duì)照?qǐng)D1　大鼠PAX6基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1　Agrose gel electrophoresis detection of PCR products of PAX6 gene

2.2重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP的鑒定

重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP克隆后的菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果顯示在1 269 bp處見目的條帶(圖3)；提取純化質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SalI 和BamHI對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果顯示在1 269 bp和6 000 bp處見目的條帶和載體條帶(圖4)。

2.3重組質(zhì)粒pEF1α- PAX6-IRES-AcGFP轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞

將轉(zhuǎn)染24 h后的293FT細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈上皮樣成片生長(zhǎng)，貼壁疏松，轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEF1α-IRES-AcGFP和重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP組的293FT細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見明顯的特異性綠色熒光，細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組未見綠色熒光表達(dá)(圖5)。Western blot蛋白結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組均未見PAX6表達(dá)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組在50.6 kDa處有特異性條帶(圖6)。

3討論

圖2　質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP部分測(cè)序結(jié)果Fig.2　A part of sequencing map of pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP plasmid

外源蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)量一般是由載體在染色體上的整合位置、啟動(dòng)子的強(qiáng)度、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性、mRNA的翻譯效率、目的蛋白的折疊效率以及目的蛋白的穩(wěn)定性等因素決定,其中前4個(gè)因素均與表達(dá)載體的選擇有關(guān)[13]。所以表達(dá)載體的選擇是決定外源蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)量的關(guān)鍵，而啟動(dòng)子的強(qiáng)度對(duì)于基因的表達(dá)起著決定性的作用。常用的啟動(dòng)子有巨細(xì)胞病毒即早期啟動(dòng)子 (PCMV- IE) 、 人延伸因子1α亞基啟動(dòng)子 (PEF-1α)和 Rous肉瘤長(zhǎng)末端重復(fù)序列等。本實(shí)驗(yàn)選用含有人延伸因子1α亞基啟動(dòng)子(PEF1α)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEF1α- IRES-AcGFP用于目的基因PAX6的表達(dá)。啟動(dòng)子PEF1α具有不受細(xì)胞周期影響，啟動(dòng)子強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，可使PEF1α啟動(dòng)子下游的蛋白實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，也適用于難轉(zhuǎn)的細(xì)胞，有利于轉(zhuǎn)染和外源蛋白的大量擴(kuò)增[12]。且該載體的多克隆位點(diǎn)中有一個(gè)IRES元件，可在PEF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)錄為雙順?lè)醋樱瑢?shí)現(xiàn)目的基因與綠色熒光報(bào)告基因(AcGFP)獨(dú)立翻譯[13]。此外，該載體能夠在流式細(xì)胞儀中高效穩(wěn)定檢測(cè)或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)目的基因與AcGFP，且可以用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，有利于后續(xù)轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞。

注：M為DNA Marker V，泳道1為陰性對(duì)照，泳道2～7為PAX6基因片段圖3　菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP Fig.3　The electrophoresis of bacterial colony PCR product of plasmid pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP

注：泳道M為DNA marker IV，泳道1為pEF1α-IRES-AcGFP雙酶切結(jié)果，泳道2為重組質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP雙酶切圖4　SalI/BamHI雙酶切鑒定真核質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFPFig.4　The electrophoresis of plasmid pEF1α-IRES-PAX6-AcGFP digested product by SalI and BamHI

注：A1、B1和C1為顯微鏡(×200)明場(chǎng)下的293FT細(xì)胞；A2 、B2和C2為顯微鏡(×200)488 nm波長(zhǎng)激發(fā)光下的293FT細(xì)胞圖5　真核質(zhì)粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞24 h后鏡下觀察(200×)Fig.5　Transfected ppEF1α-PAX6-IRES-AcGFP into 293FT cells

圖6　轉(zhuǎn)染后293FT細(xì)胞中PAX6蛋白表達(dá)Fig.6　The protein expression after PAX6 transfection in 293FT cell by western blotting analysis

在克隆目的基因PAX6時(shí)，本研究先將PAX6連接于T載體，測(cè)序正確后，再經(jīng)酶切定向插入到真核載體。T載體是TA克隆載體的簡(jiǎn)稱，是一種能夠直接克隆PCR產(chǎn)物的工具，本研究采用的pUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3’端帶有一個(gè)突出的T(脫氧胸苷)，載體的兩端可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對(duì)，在連接酶的催化下，可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體，能夠滿足基因保存和測(cè)序的需要[14-15]，且能克服常規(guī)方法中載體自連、過(guò)程復(fù)雜、克隆效率低等不足，提高了連接效率和陽(yáng)性率。293FT細(xì)胞是一種改裝過(guò)的人胚腎細(xì)胞，由293細(xì)胞派生，F(xiàn)T的含義就是帶有能復(fù)制(F)的SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制，比較容易轉(zhuǎn)染，被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)各種目標(biāo)蛋白。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用脂質(zhì)體脂質(zhì)雙分子層的融合及內(nèi)吞作用使外源基因PAX6進(jìn)入293FT細(xì)胞。

PAX6基因是PAX基因家族成員，是控制著眼球形態(tài)發(fā)生的一個(gè)重要調(diào)節(jié)基因[4-6]，在眼、神經(jīng)系統(tǒng)、鼻、胰腺和內(nèi)分泌等組織器官的發(fā)育中起著重要作用，廣泛參與細(xì)胞增殖遷移分化和黏附等生命活動(dòng)[7-8]。在眼睛發(fā)育過(guò)程中，PAX6從胚胎第8天表達(dá)，時(shí)間早于任何形態(tài)學(xué)分化[9]，表面外胚層中， PAX6表達(dá)于眼睛發(fā)育最原始的階段，基板形成前PAX6就已經(jīng)表達(dá)，一直持續(xù)表達(dá)到晶狀體分化，最終存在于成人晶狀體和角膜上皮，是眼發(fā)育的主控基因[3, 11]。Ouyang[3]的研究發(fā)現(xiàn)，將PAX6轉(zhuǎn)到皮膚上皮干細(xì)胞(Skin epithelial stem cells, SECs)中時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可以充分地將SECs轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)K5/K14的樣細(xì)胞，再將此細(xì)胞移植應(yīng)用于角膜上皮缺損的兔子模型中發(fā)現(xiàn)，移植的細(xì)胞最初位于角膜緣的地區(qū)，然后逐步向中央角膜與相應(yīng)的區(qū)域移動(dòng)，3個(gè)月后，成功修復(fù)缺損的角膜并維持正常的角膜透明度。而將敲除PAX6基因的兔LSCs移植到此模型并不能修復(fù)角膜損傷，提示PAX6在修復(fù)角膜損傷中起到?jīng)Q定性的作用。由于LSCs獲得的局限性，本課題構(gòu)建攜帶眼發(fā)育關(guān)鍵基因PAX6的真核表達(dá)載體，初步探究其在真核細(xì)胞的表達(dá)，再進(jìn)一步探討PAX6轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞并進(jìn)一步誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為L(zhǎng)SCs，以期建立穩(wěn)定細(xì)胞株，為角膜損傷提供種子細(xì)胞。

本課題成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組PAX6蛋白高表達(dá)，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組沒(méi)有PAX6蛋白表達(dá)，證明過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了293FT細(xì)胞并建立了PAX6過(guò)表達(dá)的293FT細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型，為后續(xù)研究中PAX6在真核細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用及PAX6轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜緣干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

[1] Ordonez P, Girolamo ND. Limbal epithelial stem cells: role of the niche microenvironment[J]. Stem cells, 2012(2):100-107.

[2] Yoon JJ, Ismail S, Sherwin T. Limbal stem cells: Central concepts of corneal epithelial homeostasis[J]. World journal of stem cells, 2014(4):391.

[3] Ouyang H, Yuanchao X, Ying L, et al. WNT7A and PAX6 define corneal epithelium homeostasis and pathogenesis[J]. Nature, 2014(2):358-361.

[4] Shaham O, Menuchin Y, Farhy C, et al. Pax6: A multi-level regulator of ocular development[J]. Progress in Retinal and Eye Research, 2012(5):351-376.

[5] Ashery-Padan R ,Gruss P. Pax6 lights-up the way for eye development[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2001(6):706-714.

[6] Xu S, Sunferland ME, Coles BLK, et al. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6[J]. Developmental Biology, 2007(2):713-721.

[7] Noll M. Evolution and role of Pax genes[J]. Current Opinion in Genetics & Development, 1993(4):595-605.

[9] Yao JG, Weasner BM, Wang LH, et al. Differential requirements for the Pax6(5a) genes eyegone and twin of eyegone during eye development in Drosophila[J]. Developmental Biology, 2008(2):535-551.

[10]Gehring WJ, Ikeo K. Pax6: mastering eye morphogenesis and eye evolution[J]. Trends in Genetics, 1999(9):371-377.

[11]Kozmik Z. The role of Pax genes in eye evolution[J]. Brain Research Bulletin, 2008(2-4):335-339.

[12]Novosylna O, Jurewicz E, Pydiura N, et al. Translation elongation factor eEF1A1 is a novel partner of a multifunctional protein Sgt1[J]. Biochimie, 2015(119):137-145.

[13]Abdul Mutalib NE, Matlsa N, Alitheen NB, et al. IRES-incorporated lactococcal bicistronic vector for target gene expression in a eukaryotic system[J]. Plasmid, 2014(73):26-33.

[14]Peng RH, Xiong AS, Liu J, et al. Adenosine added on the primer 5′ end improved TA cloning efficiency of polymerase chain reaction products[J]. Analytical Biochemistry, 2007(1):163-165.

[15]Adachi Y, Fukuhara C.TA strategy for rapid and efficient site-directed mutagenesis[J]. Analytical Biochemistry, 2012(1):66-68.

(2015-12-05收稿，2016-02-22修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Construction and Authenticate of Eukaryotic Expression Vector with Rat PAX6

YAN Huiwen, SU Min, GAO Jie, LIAO Wenping, YAN Lili, HUANG Yue

(DepartmentofHistologyandEmbryology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou, 550004)

[Abstract]Objective: To construct a green fluorescence protein report gene (GFP) and an eukaryotic expression vector of rat PAX6 gene and, observe its expression in 293FT cells. Methods: The rat PAX6 gene was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR). After verified correctness of sequencing by connection with T vector, the recombinant products of the pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP were gained by T4 ligase connecting pUCm-T-PAX6 and eukaryotic expression vector pEF1α-IRES-AcGFP with restriction enzymes SalⅠ/BamH. After identified by colony PCR and sequencing, pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP was transfected into 293FT cells with Lipofectamine(?)2000 assay. The expression of PAX6 protein and GFP were detected by western blot and fluorescence microscope. Results: A specific band of 1269bp was detected from recombinant plasmid pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP by digestion of SalⅠand BamHⅠand RT-PCR. Sequencing and identification showed that homology between this sequence and the rat PAX6 gene sequence from GenBank was 100%, and the size and the direction of the inserted gene were right. After transfection, 293FT cells showed green fluorescence under fluorescence microscope. A band of PAX6 protein from cells was detected by western blot assay. Conclusion: The eukaryotic expression vector of PAX6 is constructed successfully and can obtain high PAX6 protein expression in 293FT cells.

[Key words]green fluorescence protein; PAX6 gene; expression vector，eukaryotic; lipofectamine; transfection

[中圖分類號(hào)]R329.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)03-0288-06

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳基金[黔科合J字(2015)2011號(hào)]; 貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目[黔省專合字(2012)41號(hào)]

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:huranggaigaiyu@sina.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1106.058.html