張　萍，王　雄，孫姣卓

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)

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特布他林對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用研究

張萍，王雄，孫姣卓

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)

摘要：目的分析特布他林能否減輕心肌缺血再灌注損傷，并探討其機(jī)制。方法 32只雄性SD大鼠隨機(jī)平分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、特布他林(terbutaline)組、特布他林加內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNos)抑制劑(terbutaline+L-NAME)組，建立心肌缺血再灌注模型，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要給予不同處理。用蘇木素伊紅(HE)染色后在光鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變；免疫組化法測(cè)各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、eNOS蛋白的灰度值，間接反映蛋白表達(dá)量；黃嘌呤氧化酶法測(cè)各組大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、硫代巴比妥法測(cè)各組大鼠血清中丙二醛(MDA)的濃度。結(jié)果與I/R組相比，terbutaline組大鼠心肌細(xì)胞損傷程度較輕，Bcl-2及eNOS蛋白的表達(dá)、血清中SOD活力增加，而Bax的表達(dá)、血清中MDA的含量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論特布他林能通過抗凋亡、抗氧化應(yīng)激來保護(hù)心肌組織，減輕心肌缺血再灌注損傷。

關(guān)鍵詞：缺血再灌注損傷；特布他林；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；凋亡；超氧化物歧化酶；丙二醛；大鼠

隨著人口老齡化、肥胖、高血壓、糖尿病等危險(xiǎn)因素的增加，急性心肌梗死的發(fā)病率也在增高。2011年聯(lián)合國(guó)高峰會(huì)議提出，到2025年使因心血管病等的致死率降低25%(25×25目標(biāo))[1]。心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧十分敏感，及時(shí)開通冠脈恢復(fù)血流可降低致死率并改善預(yù)后，但是開通冠脈后直接面臨的問題是心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。目前因臨床缺乏理想有效的MIRI治療藥物，而引起世界各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究。β受體是交感神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)環(huán)節(jié)，也是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員，在心血管系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)過程中起重要作用。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)β2受體激動(dòng)劑能抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心功能、抑制心肌肥厚與心肌重塑，用于治療心力衰竭[2-4]，但是涉及MIRI的不多。本研究就呼吸科常用藥物特布他林對(duì)MIRI是否有保護(hù)作用及其機(jī)制展開研究，旨在為MIRI治療藥物的進(jìn)一步研究開發(fā)提供參考和思路。

1材料與方法

1．1主要試劑及儀器硫酸特布他林注射液(成都華宇制藥有限公司饋贈(zèng)，規(guī)格1 mL∶0．25 mg/支，6支/盒)；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司，每支1 g；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax、eNOS免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；HX-300動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)，RM6240B型生理實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)成都儀器廠；美國(guó)aperio公司Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)等。

1．2缺血再灌注模型制備SD大鼠稱重后，用20%烏拉坦(4 mL/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定，連續(xù)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。氣管插管，連動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣(潮氣量7 mL，呼吸頻率70次/min，吸呼比為1∶2)。于大鼠心尖搏動(dòng)明顯處逐層分離暴露心臟，輕輕打開心包，于左心耳根部下方穿線繞過冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，用套管夾閉法來阻斷冠脈血流30 min造成缺血，松開止血鉗再灌注2 h。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：夾閉后LAD供血區(qū)域顏色變暗、心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高≥0．1 mV，松開后ST回落大于50%。

1．3動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)體重200 g～250 g，32只雄性SD大鼠(中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)平分為4組：假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、特布他林(terbutaline)組、特布他林加內(nèi)皮型一氧化氮合酶抑制劑(terbutaline+L-NAME)組。Sham組 LAD下只穿線，不夾閉；I/R組：?jiǎn)渭兘?jīng)歷可逆性?shī)A閉LAD致心肌缺血30 min，隨后再灌注2 h；terbutaline組：缺血前5 min經(jīng)股靜脈注射特布他林注射液1 mg/kg；terbutaline+L-NAME組：缺血前5 min經(jīng)股靜脈注射特布他林注射液1 mg/kg，再灌注前10 min經(jīng)股靜脈注射L-NAME 10 mg/kg。再灌注2 h結(jié)束時(shí)，開腹經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血約4 mL，靜置后離心(3 000 r/min)10 min，留取上層血清，用于檢測(cè)SOD活力和MDA含量。處死大鼠，取出心臟，沖洗后放于10%的甲醛中固定，供心肌組織形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化用。血清與心肌組織標(biāo)本置于-20℃冰箱中保存，統(tǒng)一送檢。

1．4心肌組織形態(tài)學(xué)觀察從冰箱取出甲醛浸泡的32個(gè)心肌組織，分別切取梗死交界區(qū)心肌組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后，在光鏡下(×100)觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)有無變化。

1．5免疫組化方法檢測(cè)心肌中Bax、Bcl-2、eNOS蛋白的表達(dá)包埋好的蠟塊經(jīng)切片后，嚴(yán)格按試劑說明書滴加一抗、二抗，經(jīng)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)方法染色、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色等步驟后用中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。三種蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒。利用數(shù)字病理掃描及圖像分析系統(tǒng)，每個(gè)切片任選5個(gè)陽性視野，測(cè)其平均灰度值(灰度值越高，蛋白表達(dá)水平越低)。

1．6血清SOD活力、MDA含量的檢測(cè)將32個(gè)血清標(biāo)本從冰箱取出，嚴(yán)格按相應(yīng)指標(biāo)說明書執(zhí)行操作步驟，黃嘌呤氧化酶法測(cè)各組大鼠血清中超氧化物歧化酶活力、硫代巴比妥法測(cè)各組大鼠血清中丙二醛的濃度，用分光光度計(jì)測(cè)出OD值，再根據(jù)相應(yīng)公式計(jì)算各組大鼠血清中SOD活力和MDA含量。

2結(jié)果

2．1各組大鼠心肌組織(梗死交界區(qū))形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(見圖1)Sham組大鼠心肌肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞偶有水腫；I/R組大鼠心肌肌纖維排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞高度水腫；terbutaline組大鼠心肌肌纖維排列尚整齊，結(jié)構(gòu)較清晰，細(xì)胞少量水腫；terbutaline+L-NAME組心肌纖維排列亂，細(xì)胞有水腫。心肌損傷程度sham組最輕，terbutaline組次之，I/R組與terbutaline+L-NAME組較重。

圖1　4組大鼠心肌組織(梗死交界區(qū))形態(tài)

圖2　4組大鼠Bcl-2蛋白(×400)學(xué)變化的HE染色結(jié)果(×100)

圖3　4組大鼠Bax蛋白免疫組化結(jié)果(×400)

圖4　4組大鼠eNOS蛋白免疫組化結(jié)果(×400)

2．2免疫組化方法測(cè)Bcl-2、Bax、eNOS蛋白表達(dá)水平灰度值越大，蛋白表達(dá)水平越低。詳見表1、圖2～4。Bcl-2表達(dá)水平：與sham組比，I/R組的Bcl-2表達(dá)水平升高，terbutaline組的表達(dá)水平更高，terbutaline+L-NAME組比terbutaline組表達(dá)水平低，任意兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。詳見表1。

Bax表達(dá)水平：與sham組比，I/R組的Bax表達(dá)水平升高，terbutaline組的表達(dá)水平較I/R組低，terbutaline+L-NAME組較terbutaline組表達(dá)水平高，任意兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。

eNOS蛋白表達(dá)水平：與sham組比，I/R組的eNOS表達(dá)水平較低，terbutaline組的表達(dá)水平較I/R組高，terbutaline+L-NAME組較terbutaline組表達(dá)水平低，任意兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。

表1　4組大鼠心肌免疫組化灰度值(±s)

2．3大鼠血清SOD活力、MDA含量的檢測(cè)結(jié)果(見表2)與sham組比較，其余3組的SOD活力均降低，terbutaline組降低幅度最小，任意兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。與sham組比較，其余3組的MDA含量均增加，terbutaline組增加幅度最小，任意兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。

表2　4組大鼠血清中SOD活性與MDA含量(±s)

3討論

減輕心肌缺血再灌注損傷除了可采用溶栓、急診介入等手段盡早開通冠脈恢復(fù)血流，采用低壓、低溫、低鈣灌流液以外，還可使用藥物減少心肌凋亡、清除活性氧、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制、補(bǔ)充能量等措施。心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要過程，減少細(xì)胞凋亡可有效減輕心肌缺血再灌注損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R組相比，加用特布他林后心肌細(xì)胞損傷程度減輕；抗凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)增多，而促凋亡的Bax蛋白表達(dá)減少，提示特布他林有抗凋亡、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。NO已被公認(rèn)有心血管保護(hù)作用，可擴(kuò)張血管、降低血壓、松弛平滑肌，有酶活性調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化損傷等作用。Shashi Bhushan等[5]證實(shí)長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑福莫特羅的心肌保護(hù)作用是通過活化eNOS，并增加體內(nèi)NO的生物利用度來實(shí)現(xiàn)的，將β2受體-Gi蛋白-磷脂酰肌醇激酶-3-蛋白激酶B(β2AR-Gi-PI3K-Akt)信號(hào)通路擴(kuò)展為β2AR-Gi-PI3K-Akt-eNOS-NO。本研究中，與I/R組相比，terbutaline組eNOS表達(dá)增多，提示特布他林也能改善血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)NO的合成。

氧自由基的生成是MIRI的重要機(jī)制之一，SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除氧自由基，其活力可反映機(jī)體抗氧化防御水平；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映組織損傷的嚴(yán)重程度[6]。本研究中，與I/R組相比，terbutaline組血清中SOD活力增加，MDA含量減少。提示特布他林減輕MIRI的作用與其能抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

特布他林是短效β2受體激動(dòng)劑，可舒張氣道平滑肌、增加氣道纖毛擺動(dòng)等，用于緩解哮喘、肺氣腫等引起的呼吸困難。如能證實(shí)特布他林可減輕MIRI，則可拓寬特布他林的適應(yīng)證，也能為缺血再灌注病人提供一個(gè)“新”的治療藥物。鑒于特布他林對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用，這可能為減輕MIRI提供新的治療思路：特布他林可使冠心病合并呼吸系統(tǒng)疾病的病人雙重獲益；不伴有呼吸系統(tǒng)疾病的冠心病病人，特布他林可以聯(lián)合美托洛爾用于冠心病的治療。

本研究中的大鼠健康狀況良好，模型為缺血30 min、再灌注2 h，但對(duì)于伴隨多個(gè)危險(xiǎn)因素或病情復(fù)雜的病人會(huì)出現(xiàn)怎樣的預(yù)后尚未可知，以及是否存在劑量效應(yīng)關(guān)系、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系等都有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

Effect of Terbutaline on Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

Zhang Ping，Wang Xiong，Sun Jiaozhuo

First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China Corresponding Author： Wang Xiong

Abstract：ObjectiveTo explore the effect and its mechanism of terbutaline on myocardial ischemia-reperfusion(I/R) injury.MethodsThirty-two male Sprague-Dawley(SD) rats were divided into four groups randomly and equally，sham group，I/R group，terbutaline group，terbutaline+L-NAME group．I/R injury model was established.The different disposal methods were given according to the experiment．Myocardial morphology was observed under light microscope by Hematoxylin-Eosin (HE) staining method.The protein expression of Bcl-2，Bax，endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was analyzed by immunohistochemical technique．The xanthine oxidase method was used to detect superoxide dismutase (SOD) activity．The concentration of malondialdehyde(MDA) was measured by thiobarbituric acid method．ResultsCompared with the I/R group，the degree of myocardial damage in terbutaline group was significantly reduced．The expression of Bcl-2 and eNOS protein and SOD activity was significantly increased，while the expression of Bax and concentration of MDA was evidently reduced．Conclusion Terbutaline can protect myocardial tissues and attenuate myocardial I/R injury due to its anti-apoptosis，improving endothelial function，and antioxidation.

Key words：ischemia-reperfusion injury；terbutaline；endothelial nitric oxide synthase；apoptosis；rats

(收稿日期：2015-11-13)

中圖分類號(hào)：R542R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．05．013

文章編號(hào)：1672-1349(2016)05-0491-04

通訊作者：王雄，E-mail： sxwangxiong@163．com