衛(wèi)琰，朱剛，奚棟華，周曉鳴，李立志

（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，上海 201299)

允許性高碳酸血癥對大鼠肢體缺血再灌注肺損傷的影響

衛(wèi)琰，朱剛，奚棟華，周曉鳴，李立志

（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，上海 201299)

目的 研究允許性高碳酸血癥對大鼠肢體缺血再灌注肺損傷的影響。方法30只SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)和允許性高碳酸血癥-缺血再灌注組(PHC-IR組)，每組各10只。經(jīng)腹腔全麻后對PHC-IR組實(shí)行高碳酸通氣模式（吸入10%CO2+90%空氣混合氣體)3 h，使該實(shí)驗(yàn)組大鼠血?dú)釶aCO2達(dá)到并維持于60～80 mmHg。其余兩組，吸空氣3 h。IR組和PHC-IR組建立缺血再灌注模型，分離股動(dòng)脈后阻斷雙側(cè)股動(dòng)脈血流4 h后(再灌前)，松夾，恢復(fù)血流后觀察4 h(再灌后)，SH組僅手術(shù)分離雙側(cè)股動(dòng)脈，記錄各組大鼠機(jī)械通氣前、機(jī)械通氣后3 h、再灌注前、再灌注后的血?dú)夥治?。后處死大鼠，取左肺下葉組織，行肺濕干值(W/D)測定，光鏡下觀察肺組織形態(tài)，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肺組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-8的水平。結(jié)果再灌注后PHC-IR組PaO2值為(70.7±6.8)mmHg，較IR組的(60.7±4.9)mmHg明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；PHC-IR組大鼠肺組織W/D值為(4.86±0.53)，明顯低于IR組的(5.64±0.74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；IR組大鼠肺毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡間質(zhì)水腫，并有炎性細(xì)胞浸潤；SH組和PHC-IR組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺間質(zhì)肺泡腔滲出水腫較IR組減輕。PHC-IR組大鼠肺組織中TNF-α為(0.44±0.06)μg/L，IL-8為(28.3±2.6)μg/L，均明顯低于IR組的(0.83±0.18)μg/L和(33.4±3.8)μg/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論允許性高碳酸血癥可以減輕大鼠肢體缺血再灌注肺損傷，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

允許性高碳酸血癥；肢體缺血再灌注；肺損傷

外科過程，包括肢體血管的重建或者使用止血帶的手術(shù)，會使肢體處于一個(gè)長時(shí)間的缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)的過程。再灌注損傷會激發(fā)一個(gè)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，以促炎介質(zhì)產(chǎn)物和多形核白細(xì)胞聚集為特征。在遠(yuǎn)端肢體IR后，激活的多形核細(xì)胞因子在肺毛細(xì)血管的聚集從而引起肺損傷。允許性高碳酸血癥(permissive hypercapnia，PHC)作為一種肺通氣保護(hù)性策略，在某些肺疾病，如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性氣道阻塞和支氣管哮喘患者機(jī)械通氣中應(yīng)用取得較好的效果。允許性高碳酸血癥對油酸致急性肺損傷有一定保護(hù)作用[1]，但是對肢體缺血再灌注引起的急性肺損傷是否具有一定療效，可否作為缺血預(yù)處理的一種措施尚缺乏研究。本研究通過大鼠肢體缺血再灌注損傷模型的建立，探尋PHC能否減輕肢體缺血再灌注對肺的損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只(上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，體質(zhì)量200～300 g。

1.2 藥品試劑 白介素-8(IL-8)測定試劑盒、α腫瘤壞死因子測定試劑盒(均購于西門子公司)。

1.3 動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)、允許性高碳酸血癥-缺血再灌注組(PHC-IR組)，每組各10只。

1.4 高碳酸血癥模型建立 三組大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，置于手術(shù)臺上仰臥位固定，氣管插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量15～20 mL/kg，吸呼比(I:E)為1:2。SH組和IR組，吸空氣3 h，維持二氧化碳分壓(PaCO2)35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，PHC-IR組實(shí)行高碳酸通氣模式，吸入10%CO2+90%空氣混合氣體(購于上海浦江特種氣體有限公司)3 h，使該實(shí)驗(yàn)組大鼠血?dú)釶aCO2達(dá)到并維持于60～80 mmHg。

1.5 缺血再灌注模型建立 通過手術(shù)分離雙側(cè)股動(dòng)脈，假手術(shù)組進(jìn)行分離不鉗夾，IR組以及PHC-IR組均采用無創(chuàng)血管夾鉗夾雙側(cè)股動(dòng)脈4 h。IR組和PHC-IR組鉗夾4 h后進(jìn)行再灌注過程：去除血管夾，恢復(fù)血流，觀察4 h。后處死各組大鼠。

1.6 檢測指標(biāo) (1)記錄各組大鼠機(jī)械通氣前、機(jī)械通氣后3 h、阻斷雙側(cè)股動(dòng)脈血流4 h(再灌前)、恢復(fù)血流后4 h(再灌后)的血?dú)夥治觥?2)肺組織炎癥反應(yīng)各項(xiàng)指標(biāo)：①肺水含量：取左肺一小塊肺組織，用電子天平稱濕重，后置70℃烤箱中烘烤48 h，再用電子天平稱干重，計(jì)算肺組織濕干重比值(W/D比)，公式W/D=肺濕重/烘干后重量。②采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肺組織中IL-8濃度和TNF-α濃度。③肺組織病理形態(tài)：左肺組織以10%中性福爾馬林浸泡固定、石蠟包埋，HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)脈血氧分壓比較 三組大鼠通氣前PaO2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，通氣3 h后IR組和PHC-IR組PaO2較SH組有降低，但是三組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注前，PHC-IR組PaO2較IR組升高(P＜0.05)，與SH組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；再灌注后，PHC-IR組的PaO2值比SH組有降低(P＜0.05)，但高于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓分析(±s，mmHg)

表1 各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓分析(±s，mmHg)

注：與SH組比較，aP＜0.05；與IR組比較，bP＜0.05。

例數(shù)組別 通氣前 通氣后3 h 再灌注前 再灌注后SH組IR組PHC-IR組F值P值10 10 10 84.2±5.3 84.5+4.7 85.3±5.8 0.301 0.742 83.7±3.8 80.7±6.4 81.3±4.7 1.282 0.294 84.1±3.8 75.5±6.1 80.4±7.2b9.836 0.01 78.3±4.3 60.7±4.9 70.7±6.8ab27.275 0.000

2.2 肺組織濕重與干重比值 測定三組大鼠肺組織濕重與干重比值，SH組為(4.18±0.63)，IR組為(5.64±0.74)，PHC-IR組為(4.86±0.53)。與SH組比較，IR組，PHC-IR組肺組織W/D比值均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IR組比較，PHC-IR組肺組織W/D比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 TNF-α和IL-8測定 與SH組比較，IR組、PHC-IR組肺組織勻漿中IL-8、TNF-α均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與IR組比較，PHC-IR組肺組織勻漿中IL-8，TNF-α比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-8水平比較(±s，μg/L)

表2 各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-8水平比較(±s，μg/L)

組別 例數(shù)IL-8TNF-α SH組IR組PHC-IR組F值P值10 10 10 11.2±2.3 33.4±3.8ab28.3±2.6a67.312 0.000 0.32±0.21 0.83±0.18ab0.44±0.06a98.542 0.000

2.4 光鏡下形態(tài)學(xué)差異 光鏡下可見假手術(shù)組的肺泡結(jié)構(gòu)無破壞，肺泡壁完整、光滑，肺間質(zhì)無水腫，無中性粒細(xì)胞浸潤。缺血再灌注組可見肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡內(nèi)以及肺泡壁大量充血，肺間隔嚴(yán)重增厚，肺泡腔和間質(zhì)水腫明顯，并可見中性粒細(xì)胞浸潤。允許性高碳酸血癥-缺血再灌注組肺組織改變較IR組有減輕，見圖1。

圖1 三組大鼠肺組織光鏡下形態(tài)差異

3 討 論

缺血/再灌注肺損傷是指肺組織或其他組織器官遭受一定時(shí)間缺血后恢復(fù)血液灌流(再灌注)，肺組織損傷程度迅速增劇的病理現(xiàn)象[2]。外科手術(shù)，包括肢體血管的重建或者使用止血帶的手術(shù)，會使肢體處于一個(gè)長時(shí)間的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)的過程，再灌注損傷會激發(fā)一個(gè)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，以促炎介質(zhì)產(chǎn)物和多形核白細(xì)胞聚集為特征[3]。在遠(yuǎn)端肢體I/R后，激活的多形核細(xì)胞因子在肺毛細(xì)血管的聚集對于肺損傷以及急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的產(chǎn)生起到關(guān)鍵性的作用[4]。

肢體缺血/再灌注引起肺損傷的機(jī)制包括：(1)自由基的作用：在再灌注早期大量氧自由基的產(chǎn)生已被認(rèn)為導(dǎo)致組織損傷的主要機(jī)制[5]。(2)中性粒細(xì)胞的作用：分解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞血管屏障，毛細(xì)血管通透性增加，造成肺損傷和功能障礙；同時(shí)與內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)相互作用，釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等，引發(fā)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)[6]。(3)致炎小分子物質(zhì)的作用：致炎因子與抗炎因子平衡失調(diào)。(4)細(xì)胞凋亡的作用：使肺泡一毛細(xì)血管膜損傷，引起間質(zhì)性肺水腫、肺泡水腫、肺出血導(dǎo)致肺臟氣體交換障礙[7]。

在本研究中，經(jīng)過缺血再灌注過程后，IR組和PHC-IR組，其動(dòng)脈血氧分壓較SH組均有下降，表明肢體缺血再灌注過程會對肺產(chǎn)生一定損傷。但是，PHC-IR組較IR組肺損傷程度減輕，其氧分壓值較IR組下降減少，表明允許性高碳酸血癥可以從一定程度上減輕肢體缺血再灌注對肺臟的損傷，但是卻不能預(yù)防損傷的產(chǎn)生。

允許性高碳酸血癥作為一種肺通氣的保護(hù)策略在成人某些肺疾病，如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性氣道阻塞和支氣管哮喘患者機(jī)械通氣中應(yīng)用取得較好的效果，明顯降低了氣漏、肺實(shí)質(zhì)損傷及脫機(jī)困難等并發(fā)癥的發(fā)生[8]。高碳酸血癥下會對機(jī)體產(chǎn)生一系列的影響。高碳酸性酸中毒可引起肺血管收縮，它引起的收縮作用比低氧引起的收縮作用弱，并可在肺缺血時(shí)加強(qiáng)肺血管收縮。同時(shí)偏酸血液再灌注對中性粒細(xì)胞活化的抑制使IL-8含量降低，從而減輕再灌注引起的炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能為：(1)偏酸血液可抑制細(xì)胞膜上Na+/H+交換蛋白的激活，從而減少中性粒細(xì)胞的活化，抑制自由基產(chǎn)生，減輕肺組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；(2)減輕鈣超載；(3)偏酸血液再灌注時(shí)，可通過影響細(xì)胞膜上的脂多糖與其受體結(jié)合，終止刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制TNF-α生成，從而減輕炎性反應(yīng)[9]。本研究中，免疫酶聯(lián)法監(jiān)測三組大鼠肺組織中的炎癥反應(yīng)因子(TNF-α和IL-8)，發(fā)現(xiàn)PHC-IR組較IR組明顯下降，可見允許性高碳酸血癥這一通氣模式可以通過減輕肺臟的炎癥反應(yīng)，達(dá)到肺保護(hù)的目的。

綜上所述，采取允許性高碳酸血癥這一肺通氣模式作為缺血預(yù)處理，可以有效地減輕肢體缺血再灌注對肺臟的損傷。

[1]楊麗麗,劉志,戢新平,等.高碳酸血癥對急性肺損傷動(dòng)物模型的保護(hù)作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(4):275-277.

[2]顧晴,何建國,程顯聲.缺血/再灌注肺損傷動(dòng)物模型的建立方法[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2001,18(2):191-192.

[3]Chatterjee PK.Novel pharmacological approaches to the treatment of renal ischemia/reperfusion injury[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2007,376(1-2):1-43.

[4]Denis WH,Aires AB,Kevin MC,et al.Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury[J].J Vasc Surg,2002,35:1264-1273.

[5]Seekamp A,Mulligan MS,Till GO,et a1.Requirements for neutmphil products and L-arginine in isehemia-reperfusion injury[J].AmJ Pathol,1993,142(4):1217-1226.

[6]Demiryurek AT,Wadsworth RM.Superoxide in the pulmonary circulation[J].Pharmacol Ther,1999,84(3):355-365.

[7]門秀麗,張連元,董淑云,等.?；撬釋Υ笫笾w缺血/再灌注后肺損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2004,20(3): 421-424.

[8]Finn A,Naik S,KIein N,et a1.Intedeukin-8 release and neutrophil dogranulotion after cardiopulmonary bypass[J].J Thorac cardiovasc Surg,1993,105(2):234-241.

[9]Huber AR，Kunkd SL,Todd RF 3rd，et a1.Regulation of trang endothelial neutrophil migration by endogenous interleukin-8[J].Science,1991,254(5028):99-102.

Protective effects of permissive hypercapnia on lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats.

WEI Yan,ZHU Gang,XI Dong-hua,ZHOU Xiao-ming,LI Li-zhi.Department of Anesthesiology,Shanghai Pudong New Area People's Hospital,Pudong 201299,Shanghai,CHINA

ObjectiveTo observe the protective effects of permissive hypercapnia on lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats.MethodsA total of 30 male SD rats were randomly divided into the sham-operated group(SH group),the ischemia reperfusion group(IR group),and the permissive hypercapnia-ischemia-reperfusion group(PHC-IR group),with 10 rats in each group.PHC-IR group was treated with hypercapnic ventilation mode after general anesthesia(inhalation of 10%CO2+90%air-gas mixture)for 3 hours,so that the rats'blood Pa-CO2was maintained at 60～80 mmHg.The remaining two groups received general ventilation mode(air)for 3 hours.IR group and PHC-IR group established ischemia reperfusion injury model,isolated femoral artery,and block double side for 4 hours(before reperfusion).After blood flow was recovered and observed for 4 hours(after reperfusion),SH group only underwent surgery separation femoral artery.Artery blood gas analysis was recorded before mechanical ventilation, mechanical ventilation for 3 hours,before reperfusion,and after reperfusion.After rats were killed,the left lower lobe of the lung tissue was removed,the Wet/Dry weight ratio was determined,tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin (IL)-8 levels in lung tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsCompared with IR group, the PaO2value of PHC-IR group significantly increased after reperfusion((70.7±6.8)mmHg vs(60.7±4.9)mmHg,P＜0.05);W/D ratio in lung tissue of rats in the PHC-IR group was significantly reduced((4.86±0.53)vs(5.64±0.74),P＜0.05).There was dilated congestive lung capillaries,the alveolar interstitial edema and inflammatory cell infiltration in IR group;but in SH group and PHC-IR group,alveolar structure were more complete,interstitial pulmonary edema of alveolar exudate were reduced.TNF-α and IR IL-8 levels in PHC-IR group were significantly decreased than IR group ((0.44±0.06)μg/L vs(0.83±0.18)μg/L;(28.3±2.6)μg/L vs(33.4±3.8)μg/L,P＜0.05).ConclusionThe permissive hypercapnia reduced lung injury induced by ischemia-reperfusion of hind limbs in rats and its mechanism may be related to inhibiting the inflammatory response.

Permissive hypercapnia;Ischemia-reperfusion of hind limbs;Lung injury

R-332

A

1003—6350（2016）18—2934—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.004

2016-04-11)

上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院科研資助項(xiàng)目（編號：E12-02）

衛(wèi)琰。E-mail：xiancairousi@163.com