慕生枝，康蓓，孫要文，王國(guó)棟，徐子寒

（陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科1、神經(jīng)內(nèi)二科2，陜西 西安 710068）

褪黑激素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

慕生枝1，康蓓2，孫要文1，王國(guó)棟1，徐子寒1

（陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科1、神經(jīng)內(nèi)二科2，陜西 西安 710068）

目的 探討褪黑激素對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制。方法收集人皮膚增生性瘢痕標(biāo)本，原代培養(yǎng)人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSFBs)。將HSFBs細(xì)胞根據(jù)不同的處理方法分為空白對(duì)照組、低濃度褪黑激素組、中濃度褪黑激素組、高濃度褪黑激素組、NVP-BEZ235處理組、NVP-BEZ235+褪黑激素組、褪黑激素+siRNA-PTEN組、褪黑激素+siRNA-scramble組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)、CyclinD1和Caspase-3的表達(dá)以及PI3k/AKt/mTOR通路相關(guān)蛋白p-Akt和p-mTOR的蛋白水平。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，從低到高濃度褪黑激素均能夠減少HSFBs細(xì)胞同一時(shí)間點(diǎn)OD值，上調(diào)PTEN和Caspase-3表達(dá)量，同時(shí)抑制CyclinD1、p-Akt和p-mTOR表達(dá)水平，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)與高濃度褪黑激素組比較，NVP-BEZ235+褪黑激素組中細(xì)胞增殖顯著被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；沉默PTEN后拮抗褪黑激素對(duì)HSFBs細(xì)胞增殖和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論褪黑激素通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活化從而抑制HSFBs細(xì)胞增殖。

褪黑激素；磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)；PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路；細(xì)胞增殖

在組織損傷修復(fù)過(guò)程中常常伴隨瘢痕的形成，這是一種正常生理表現(xiàn)，也是創(chuàng)面愈合的最終結(jié)果。然而組織過(guò)度增生形成的增生性瘢痕則是一種病理性瘢痕，是人類皮膚特有的一種病理性改變[1-2]。研究表明增生性成纖維細(xì)胞 (hypertrophic scar fibroblasts cells，HSFBs)的凋亡減少和增殖過(guò)度是形成增生性瘢痕的核心因素[3]。因此有效抑制HSFBs過(guò)度增殖是改善瘢痕組織病變的主要途徑。褪黑激素是一種主要由松果腺合成與分泌的吲哚類生物活性物質(zhì)[4]，研究表明褪黑激素能夠抑制多種腫瘤的發(fā)展，例如乳腺癌、肝癌、黑色素瘤等，且機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖以及誘導(dǎo)凋亡有關(guān)[5-7]。目前，已經(jīng)報(bào)道褪黑激素能夠抑制HSFBs產(chǎn)生ROS，拮抗TGF-β1對(duì)HSFBs的轉(zhuǎn)化作用[8]。但是褪黑激素對(duì)于HSFBs增殖的影響及其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)HSFBs，探討褪黑激素對(duì)其增殖的影響作用及其作用機(jī)制，為臨床采用褪黑激素治療增生性瘢痕提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 澳洲優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自中國(guó)凱諾生物技術(shù)公司，兔抗人PTEN多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、兔抗人CyclinD1單克隆抗體、兔抗人p-mTOR單克隆抗體以及兔抗人Caspase-3單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell signaling technology公司，qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Ta-KaRa公司。NVP-BEZ235和褪黑激素購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。

1.2 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取得患者或監(jiān)護(hù)人同意后，收集本醫(yī)院燒傷整形外科2013年2月至2014年1月期間整形手術(shù)中切除的6例增生性瘢痕組織。6例組織分離于患者四肢或腹部燒傷創(chuàng)面愈合后6個(gè)月～1年增生性瘢痕組織，患者年齡12～50歲，均無(wú)合并基礎(chǔ)疾病并且瘢痕組織無(wú)潰瘍現(xiàn)象。采用組織塊法進(jìn)行HSFBs分離與培養(yǎng)：用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗增生性瘢痕組織，剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，浸泡于0.25% DispaseⅡ中，置于37℃恒溫?fù)u床中，120 r/min震蕩2 h，用0.1 mol/L PBS反復(fù)洗滌，剪成1 mm3大小，接種于培養(yǎng)瓶中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。加入含10%胎牛血清的DMEM液，待原代細(xì)胞生長(zhǎng)成單層融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化后分瓶傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用第3代細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察HSFBs生長(zhǎng)形態(tài)。

1.3 HE染色 用PBS清洗制備好的細(xì)胞爬片15 min，將蓋玻片按順序依次放置于玻片架上，浸沒于蘇木素中15 min，移入鹽酸酒精分化30 s，浸泡于伊紅中3 min，流水沖洗至無(wú)色，依次放85%、95%酒精各自3 min，無(wú)水酒精脫水10 min，沾少量樹脂滴于載玻片上，封片并晾干后放37℃恒溫箱中烘烤，熒光顯微鏡采集圖像。

1.4 HSFBs分組處理 將HSFBs細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，使其融合度為40%的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)處理方法的不同將HSFBs細(xì)胞分為以下幾組：①空白對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)；②低濃度褪黑激素組：加入褪黑激素(用DMEM培養(yǎng)基配制成母濃度為0.1 mmol/L的母液)使其終濃度為10-5mmol/L，共同培養(yǎng)48 h；③中濃度褪黑激素組：加入褪黑激素使其終濃度為10-3mmol/L，共同培養(yǎng)48 h；④高濃度褪黑激素組：加入褪黑激素使其終濃度為0.1 mmol/L，共同培養(yǎng)48 h；⑤NVP-BEZ235處理組：加入NVP-BEZ235使其終濃度為1 μmol/L，共同培養(yǎng)48 h；⑥NVP-BEZ235+褪黑激素組：加入NVP-BEZ235使其終濃度為1 μmol/L，共同培養(yǎng)48 h，再加入褪黑激素，使其終濃度為0.1 mmol/L，共同培養(yǎng)48 h；⑦褪黑激素+siRNA-scramble組：按照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，首先用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋siRNA-scramble，充分混勻后加入Lipofectamine 2000，室溫孵育15 min后加入細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再加入褪黑激素，使其終濃度為0.1 mmol/L，共同培養(yǎng)48 h；⑧褪黑激素+siRNA-PTEN組：首先用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋siRNA-PTEN，其余步驟同⑦。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別取各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×103個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔體積為200 μL，每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，各培養(yǎng)24 h、36 h、48 h和72 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)，37℃培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，室溫避光搖床震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。以空白孔為對(duì)照，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，OD值的大小表示細(xì)胞增殖能力的大小。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PTEN、CyclinD1和Caspase-3 mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，根據(jù)按照GREEN spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取總RNA。按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script?RT Master Mix Perfect Real Time的操作說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈。根據(jù)TaKa-Ra熒光定量PCR試劑盒操作說(shuō)明，于熒光定量PCR儀上進(jìn)行操作。設(shè)置PCR循環(huán)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。每次實(shí)驗(yàn)以相應(yīng)融解曲線和2%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。全部反應(yīng)結(jié)束后，F(xiàn)TC-3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀附帶的分析軟件自動(dòng)分析、計(jì)算出樣品的△CT值，以比較域值法將其與同一樣本內(nèi)參基因β-actin的△CT值相比，即△△CT=待測(cè)基因△CT值-內(nèi)參△CT值，而檢測(cè)基因mRNA表達(dá)的相對(duì)量=2-△△CT。所用引物均有上海生工技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

基因名稱PTEN CyclinD1 Caspase-3 β-actin引物序列(5'-3') F:5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3' R:5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3' F:5'-GGAAGAGGACTACTGGATTGAC-3' R:5'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-3' F:5'-CCAGAACCGCAGTGAAGAGT-3' R:5'-GGGATAGATAAACAGGGAAAC-3' F:5'-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3' R:5'-GGACTCATCCTACTCCTGCT-3'

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PTEN、CyclinD1、Caspase-3、p-Akt和p-mTOR表達(dá) 收獲各組處理后的細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。取25 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，放入TBST配制5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下約1 h，分別加一抗(所用的一抗稀釋比例分別為PTEN抗體1:1 000、CyclinD1抗體1:2 000、Caspase-3抗體1:1 000、p-Akt抗體1:1 000和p-mTOR抗體1:1 000)，4℃反應(yīng)過(guò)夜，PBS洗膜5次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min，PBS洗膜5次。暗室中在PVDF膜上滴加適量的ECL染色，壓片曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，室溫下晾干，膠片掃描，應(yīng)用Image J軟件分析灰度值。用目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值表示各組樣本目的蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSFBs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及HE染色 倒置相差顯微鏡觀察HSFBs：呈長(zhǎng)梭狀，細(xì)胞核呈類圓形或是長(zhǎng)橢圓形，核仁個(gè)數(shù)不等，細(xì)胞漿向兩極突起，細(xì)胞排列不規(guī)則，數(shù)量增加后呈旋渦狀分布(圖1a)。細(xì)胞爬片HE染色：成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，胞漿為粉紅色，胞核為淡藍(lán)色，結(jié)合分離的組織來(lái)源，可證實(shí)此細(xì)胞為成纖維細(xì)胞(圖1b)。

2.2 各劑量褪黑激素對(duì)HSFBs增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，不同濃度褪黑激素處理均能夠降低同一時(shí)間點(diǎn)OD值，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

圖1 HSFBs細(xì)胞形態(tài)觀察及HE染色（×100）

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間在490 nm下OD值(±s)

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間在490 nm下OD值(±s)

組別空白對(duì)照組低濃度褪黑激素組中濃度褪黑激素組高濃度褪黑激素組檢驗(yàn)值P值24 h 0.153±0.016 0.145±0.012a0.136±0.024ab0.124±0.017ac480.380 0.000 36 h 0.396±0.012 0.364±0.018a0.310±0.016ab0.285±0.011ac168.000 0.000 48 h 0.599±0.011 0.540±0.009a0.504±0.025ab0.475±0.016ac227.583 0.000 72 h 0.752±0.011 0.704±0.015a0.685±0.018ab0.526±0.017ac585.111 0.000

2.3 各劑量褪黑激素對(duì)PTEN及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、Caspase-3表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，不同濃度褪黑激素處理均能夠逐漸增加細(xì)胞中PTEN和Caspase-3的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)量，降低CyclinD1的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 各劑量褪黑激素對(duì)PTEN、CyclinD1和Caspase-3表達(dá)的影響

2.4 各劑量褪黑激素抑制PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路的激活 與空白對(duì)照組比較，不同濃度褪黑激素處理均能夠降低細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR蛋白水平，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 各劑量褪黑激素抑制PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路的激活

2.5 PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路參與褪黑激素調(diào)控HSFBs增殖 與空白對(duì)照組比較，NVP-BEZ235處理組細(xì)胞中OD值顯著減小，細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1表達(dá)下降，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但對(duì)PTEN表達(dá)無(wú)影響。與高濃度褪黑激素組比較，NVP-BEZ235+褪黑激素組OD值明顯減小，細(xì)胞增殖受到嚴(yán)重抑制，同時(shí)CyclinD1表達(dá)下降，Caspase-3表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但對(duì)PTEN的表達(dá)無(wú)影響，見表3和圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PTEN、CyclinD1和Caspase-3表達(dá)

2.6 沉默PTEN拮抗褪黑激素對(duì)PI3k/AKt/ mTOR信號(hào)通路的抑制 與高濃度褪黑激素組比較，褪黑激素+siRNA-PTEN組細(xì)胞中p-PI3k和p-mTOR蛋白水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

表3 各組細(xì)胞不同時(shí)間在490 nm下OD值(±s)

表3 各組細(xì)胞不同時(shí)間在490 nm下OD值(±s)

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05，與高濃度褪黑激素組比較，bP＜0.05。

組別空白對(duì)照組NVP-BEZ235處理組高濃度褪黑激素組NVP-BEZ235+褪黑激素組檢驗(yàn)值P值24 h 0.153±0.016 0.130±0.012a0.124±0.017a0.091±0.012b1 615.200 0.000 36 h 0.396±0.012 0.290±0.018a0.285±0.011a0.190±0.016b1 449.333 0.000 48 h 0.599±0.011 0.482±0.021a0.475±0.016a0.320±0.018b2 356.755 0.000 72 h 0.752±0.011 0.531±0.016a0.526±0.017a0.402±0.011b945.333 0.000

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中p-PI3k和p-mTOR蛋白水平

3 討 論

增生性瘢痕是燒傷、創(chuàng)傷和手術(shù)后常見的并發(fā)癥，是創(chuàng)傷皮膚的病理性愈合過(guò)程，但目前仍缺乏治療增生性瘢痕的有效方法[9]，因此，深入了解增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制，尋求治療增生性瘢痕的手段仍是目前急需解決的重點(diǎn)問(wèn)題之一[10]。創(chuàng)傷愈合過(guò)程中HSFBs的異常增殖是目前比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制[11]。因此，抑制HSFBs的過(guò)度增殖將能夠有效控制增生性瘢痕的形成，成為治療瘢痕的有效手段。

褪黑激素是由松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素[12]。各種實(shí)驗(yàn)表明，褪黑激素能有效抑制多種惡性腫瘤腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，例如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等，同時(shí)研究表明褪黑激素抑制腫瘤的機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)凋亡有關(guān)[13-15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素能抑制細(xì)胞增殖通過(guò)阻止下游CyclinD1的表達(dá)使細(xì)胞進(jìn)入S期[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)不同濃度劑量的褪黑激素均能夠抑制HSFBs增殖，增加PTEN的表達(dá)量，同時(shí)抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。這表明外源性補(bǔ)充褪黑激素能夠有效抑制HSFBs細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期。對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量褪黑激素均能夠下調(diào)p-Akt和p-mTOR蛋白水平，這表明褪黑激素抑制細(xì)胞增殖可能與抑制PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路激活有關(guān)。

在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路中，PI3k/AKt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用尤其重要[17]。已經(jīng)證實(shí)該通路的活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖[18]。在本研究中，與空白對(duì)照組比較，NVP-BEZ235處理組細(xì)胞增殖嚴(yán)重受到抑制，CyclinD1表達(dá)量降低，Caspase-3的表達(dá)量增加，同時(shí)與高濃度褪黑激素組比較，NVP-BEZ235+褪黑激素組中細(xì)胞增殖顯著被抑制，CyclinD1表達(dá)量顯著降低，Caspase-3的表達(dá)量顯著增加。這表明PI3k/AKt/mTOR信號(hào)參與了HSFBs增殖與凋亡的調(diào)節(jié)，同時(shí)證實(shí)了褪黑激素通過(guò)抑制PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路的激活從而抑制HSFBs細(xì)胞增殖。

PTEN是一種具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與發(fā)育[19]。以往研究表明，PTEN缺失能夠?qū)е翽I3k/AKt通路的活化，同時(shí)AKt通過(guò)活化mTOR增加CyclinD1 mRNA翻譯，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)，沉默PTEN表達(dá)之后，細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR表達(dá)增加，拮抗了褪黑激素對(duì)PI3k/ AKt/mTOR信號(hào)通路的抑制作用。這表明褪黑激素通過(guò)調(diào)控PTEN的表達(dá)抑制PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步抑制HSFBs過(guò)度增殖。

綜上所述，褪黑激素能夠抑制HSFBs增殖，抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinD1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，這一作用是通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)抑制PI3k/AKt/mTOR信號(hào)通路的激活而實(shí)現(xiàn)。這為臨床上采用褪黑激素治療增生性瘢痕提供了理論依據(jù)。

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Study on the effect and mechanism of melatonin on proliferation of fibroblasts in hypertrophic scar.

MU Sheng-zhi1,KANG Bei2,SUN Yao-wen1,WANG Guo-dong1,XU Zi-han1.Department of Burns and Plastic Surgery1,the Second Department of Neurology2,Shaanxi Provincial People's Hospital,Xi'an 710068,Shaanxi,CHINA

Objective To study the effect and mechanism of melatonin on proliferation of fibroblasts in human hypertronhic scar.MethodsThe human skin hypertrophic scar(HSFBs)specimens were collected.Fibroblasts from hypertrophic scar were isolated by tissue culturing method.HSFBs were divided into different groups:blank control group,low concentration melatonin group,middle concentration melatonin group,high concentration melatonin group, NVP-BEZ235 treatment group,NVP-BEZ235+melatonin group,melatonin+siRNA-PTEN group,melatonin+siRNA-scramble group.Cells proliferation was detected by MTT.The expression of phosphatase and tensin homolog (PTEN),CyclinD1,Caspase-3 as well as the protein levels of PI3k/AKt/mTOR pathway related protein p-Akt and p-mTOR were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)and western blot respectively.ResultsCompared with the blank control group,from the low to high concentrations of melatonin can significantly decrease the OD value of HSFBs cells at the same time,increase the expression of PTEN and Caspase-3,meanwhile inhibited the expression levels of Cyclind1,p-Akt and p-mTOR,with statistically significant differences between the four groups(P＜0.05).Compared with the high concentration melatonin group,the cell proliferation was significantly inhibited in the NVP-BEZ235+melatonin group,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The inhibitory effect of melatonin+siRNA-PTEN group on HSFBs cell proliferation and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway was observed, and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionMelatonin could inhibit HSFB cells proliferation by upregulating the expression of PTEN and inhibiting the activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathways.

Melatonin;Phosphatase and tensin homolog(PTEN);PI3k/AKt/mTOR signaling pathways;Cell proliferation

R75

A

1003—6350（2016）18—2927—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.002

2016-03-11)

孫要文。E-mail：shidasda@163.com