袁麗，劉芳，鄔開(kāi)朗，李一榮

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430071；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

丙肝病毒感染對(duì)C反應(yīng)蛋白表達(dá)的影響

袁麗1，劉芳2，鄔開(kāi)朗2，李一榮1

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430071；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

目的 探討丙型肝炎病毒(HCV)在體內(nèi)外對(duì)C反應(yīng)蛋白(CRP)表達(dá)的影響。方法收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院2015年1月至2016年2月HCV感染患者標(biāo)本106例和健康體檢者標(biāo)本110例，免疫透射比濁法檢測(cè)其血清CRP水平，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞中CRP mRNA的表達(dá)。結(jié)果HCV感染患者血清CRP水平為(8.62±5.56)mg/L，顯著高于健康體檢者的(1.35±0.71)mg/L，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞中CRP mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照細(xì)胞高，其CRP/β-actin灰度比值分別為0.31和1.5。結(jié)論HCV感染能夠上調(diào)肝細(xì)胞CRP的表達(dá)。

丙型肝炎病毒；C反應(yīng)蛋白；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；表達(dá)

丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起人類(lèi)丙型肝炎的病原體，全球約1.7億人感染HCV，50%～80%的患者會(huì)轉(zhuǎn)變成為慢性感染患者，其中10%～20%的慢性感染者發(fā)展為肝硬化，每年1%～4%的肝硬化患者最終發(fā)展成為原發(fā)性肝癌(HCC)[1]。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在臨床感染性疾病、心血管疾病診斷、監(jiān)測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用[2]。HCV感染能夠引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，但目前為止，HCV對(duì)CRP表達(dá)的影響還不清楚。本研究主要通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討HCV對(duì)CRP表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院2015年1月至2016年2月期間HCV感染的患者106例(HCV患者組)，其中男性62例，女性41例，平均年齡(53.2±21.5)歲。所有HCV患者抗-HCV及HCV RNA均為陽(yáng)性，其診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《丙型肝炎防治指南》。健康對(duì)照組為110例健康體檢者，其中男性57例，女性53例，平均年齡(46.3±17.2)歲，所有患者均排除心、腦、腎等重要器官疾病及呼吸道病毒和其他嗜肝病毒感染。受檢者均采集清晨空腹靜脈血3 mL，分離后的血清于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.2 材料 人肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1及HCV病毒JFH-1株感染的Huh7.5.1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CTCC)；RNA提取試劑TRIzol R和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自Invitrogen公司；血清CRP的檢測(cè)購(gòu)自寧波普瑞柏生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Huh7.5.1細(xì)胞在含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè) 從TRIzolR試劑提取含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對(duì)照細(xì)胞的總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用CRP基因的檢測(cè)引物5′-TCCCAA GGATTGAGTTATG-3′(上游引物)，5′-GTGGTCAAG GCTCTGTTG-3′(下游引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為對(duì)照[3]，PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，然后按94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)25次，最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 血清CRP檢測(cè) 血清標(biāo)本及細(xì)胞上清中CRP檢測(cè)采用免疫透射比濁法。使用全自動(dòng)生化分析儀ADVIA2400進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受檢者的CRP血清水平比較 CRP在健康對(duì)照組為(1.35±0.71)mg/L，在HCV組為(8.62± 5.56)mg/L，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.654，P＜0.01)。

2.2 HCV在細(xì)胞水平上調(diào)CRP的表達(dá) 與對(duì)照細(xì)胞比較，感染了HCV的Huh7.5.1細(xì)胞CRP mRNA表達(dá)水平升高，CRP/β-actin灰度比值分別為0.31和1.52。同時(shí)，感染了HCV的Huh7.5.1細(xì)胞上清中CRP含量為(11.64±0.85)mg/L，明顯高于對(duì)照細(xì)胞的(2.59±0.38)mg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.742，P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)CRP mRNA的表達(dá)

3 討 論

CRP是環(huán)狀五球體蛋白，屬于Oligomeric鈣結(jié)合蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約120 kD。表達(dá)人類(lèi)CRP的基因位于染色體1q21-1q23，由5個(gè)相同的單體以非共價(jià)鍵構(gòu)成，CRP主要由肝臟合成，在炎癥、腫瘤以及急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者中顯著升高[2]。

乙肝病毒(HBV)和HCV感染機(jī)體后均引起肝臟的炎癥反應(yīng)，研究表明，乙肝病毒能夠上調(diào)CRP的表達(dá)[4]。為探討HCV對(duì)CRP的調(diào)節(jié)作用，在本研究中，我們檢測(cè)了HCV患者及健康對(duì)照組CRP的血清學(xué)水平，發(fā)現(xiàn)HCV患者血清CRP水平顯著高于健康對(duì)照組，證實(shí)了丙肝病毒在體內(nèi)對(duì)CRP具有上調(diào)作用。進(jìn)一步采用RT-PCR檢測(cè)了HCV病毒感染的Huh7.5.1細(xì)胞和及其對(duì)照細(xì)胞中CRP的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，HCV病毒感染的Huh7.5.1中CRP的mRNA含量明顯高于對(duì)照細(xì)胞，且HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞上清中CRP的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照細(xì)胞，表明HCV能夠在體內(nèi)上調(diào)CRP的表達(dá)。

HCV本身不具有肝細(xì)胞毒性，宿主的免疫因素對(duì)HCV感染的不同結(jié)局起到?jīng)Q定性的作用。HCV可觸發(fā)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，造成免疫介導(dǎo)的肝損傷，臨床表現(xiàn)為慢性肝炎、肝硬化和肝癌等。細(xì)胞因子將固有免疫和適應(yīng)性免疫連接起來(lái)，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)與調(diào)節(jié)中扮演重要角色。研究表明，多種白細(xì)胞介素與HCV的感染和致病密切相關(guān)，包括白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-23和IL-27等[5-7]。其中，IL-6是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，也是CRP基因表達(dá)的主要調(diào)控因子，可在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成CRP，且這一作用可被IL-1β加強(qiáng)[8]。研究表明，HBV通過(guò)HBV x蛋白的反式激活作用上調(diào)IL-1β和IL-6基因的表達(dá)[9]，進(jìn)而促進(jìn)CRP的合成和分泌。因此，我們推測(cè)，HCV也可能是通過(guò)上調(diào)IL-1β或IL-6而間接上調(diào)CRP基因的表達(dá)。

總之，本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HCV能夠上調(diào)CRP的表達(dá)，但HCV調(diào)節(jié)CRP表達(dá)的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1]Walker CM,Grakoui A.Hepatitis C virus:why do we need a vaccine to prevent a curable persistent infection?[J].Curr Opin Immunol. 2015,35:137-43.

[2]Skogmar S,Sch?n T,Balcha TT,et al.Plasma levels of neopterin and C-reactive protein(CRP)in tuberculosis(TB)with and without HIV coinfection in relation to CD4 cell count[J].PLoS One,2015,10 (12):e0144292.

[3]祝成亮,李艷,劉興暉,等.丙型肝炎病毒對(duì)白細(xì)胞介素32表達(dá)影響的研究[J].海南醫(yī)學(xué),2014,9(25):2708-2709.

[4]高國(guó)生,朱海超,胡愛(ài)榮,等.乙型肝炎病毒對(duì)超敏C反應(yīng)蛋白表達(dá)的影響及其臨床意義[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2011,31 (10):931-933.

[5]Omran MH1,Ibrahim NE,Youssef SS,et al.Relation of interleukin-1 β gene to treatment response in chronic patients infected with HCV genotype 4[J].J Infect Dev Ctries,2013,7(11):851-858.

[6]Torbati E,Ghassab RK,Davachi ND.Recombinant HCV core protein and the secretion of associated cytokines(IL-6,TNF-α and IFN-γ)in immunized mice[J].Pak J Biol Sci,2013,16(24): 2042041-5.

[7]Ashrafi Hafez A,Ahmadi Vasmehjani A,Baharlou R,et al.Analytical assessment of interleukin-23 and-27 cytokines in healthy people and patients with hepatitis C virus infection(genotypes 1 and 3a)[J]. Hepat Mon,2014,14(9):e21000.

[8]Bacci MR,Leme RC,Zing NP,et al.IL-6 and TNF-α serum levels are associated with early death in community-acquired pneumonia patients[J].Braz J Med Biol Res,2015,48(5):427-432.

[9]Xiang WQ,Feng WF,Ke W,et al.Hepatitis B virus X protein stimulates IL-6 expression in hepatocytes via a MyD88-dependent pathway[J].J Hepatol,2011,54(1):26-33.

Effect of hepatitis C virus infection on the expression of C-reactive protein.

YUAN Li1,LIU Fang2,WU Kai-lang2, LI Yi-rong1.1.Department of Clinical Laboratory,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA; 2.College of Life Sciences of Wuhan University,Wuhan 430072,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of C-reactive protein(CRP)in vitro and in vivo.MethodsAtotal of 106 samples of HCV infected patients and 110 samples of healthy individuals in Zhongnan Hospital of Wuhan University from January 2015 to February 2016 were collected.Serum CRP levels were measured by immune transmission turbidity method.The expression of CRP mRNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV and control cells was measured by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsSerum CRP levels were(8.62±5.56)mg/L in patients with HCV infection,which were significantly higher than those in healthy individuals(1.35±0.71)mg/L,with statistically significant difference(P＜0.01).The expression level of CRP mRNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV was significantly higher compared with that in control cells,and the gray ratio of CRP/beta-actin was 0.31 and 1.5 respectively.ConclusionHCV infection can upregulate the expression of CRP in liver cells.

Hepatitis C virus;C-reactive protein;Reverse transcription polymerase chain reaction;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2016）18—2932—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.003

2016-04-15)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31270206）

李一榮。E-mail：liyirong838@163.com