趙宗霞，陳慶，王治榮，相萌，李芬霞，梁婉琪，加秋萍，張美

(1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710038；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710005；3.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院婦科，陜西 西安 710072；4.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系婦產(chǎn)科教研室，陜西 西安 710021)

SOX2在宮頸癌中的表達及其臨床意義

趙宗霞1，陳慶2，王治榮3，相萌4，李芬霞1，梁婉琪1，加秋萍1，張美1

(1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710038；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710005；3.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院婦科，陜西 西安 710072；4.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系婦產(chǎn)科教研室，陜西 西安 710021)

目的 探討腫瘤干細胞相關(guān)基因SOX2在宮頸癌中的表達情況及其臨床意義。方法選取西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年1月至2015年6月住院手術(shù)治療的58例宮頸癌患者的宮頸癌組織作為宮頸癌組，同時選取同一患者的正常宮頸組織作為對照組，檢測兩組標(biāo)本組織中SOX2表達的差異。結(jié)果宮頸癌組標(biāo)本的SOX2蛋白陽性率為62.07%(36/58)，明顯高于對照組的6.90%(4/58)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；宮頸癌組標(biāo)本的SOX2 mRNA表達水平為(14.28±3.41)，明顯高于對照組的(1.32±0.61)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；高分化宮頸癌組標(biāo)本的SOX2蛋白陽性率為34.29%(12/35)，明顯低于中、低分化宮頸癌組的82.61%(19/23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；SOX2蛋白在不同年齡(年齡≥60歲與＜60歲)、不同病理類型(鱗癌、腺癌)、不同臨床分期中的表達陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論SOX2在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常宮頸組織，并且與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)。

SOX2；宮頸癌；腫瘤分化；臨床意義

目前，惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病之一，而宮頸癌僅次于乳腺癌，是全球婦女第二高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率在發(fā)展中國家居首位。Parkin等[1]曾報道全世界每年新發(fā)生宮頸癌病例數(shù)約為46.5萬(占女性新發(fā)癌癥病例的15%)，其中我國每年新發(fā)病例約13.15萬，約占總數(shù)的1/3。宮頸癌早期患者可無明顯癥狀、體征，婦科檢查患者宮頸可光滑或伴鱗-柱狀上皮異位，隨著疾病進展，患者可出現(xiàn)異常陰道出血、陰道溢液等癥狀，晚期患者癥狀則與病灶累及范圍有關(guān)，患者可能出現(xiàn)尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等癥狀，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及壽命。宮頸癌早期診斷是其診治的關(guān)鍵，目前臨床常通過宮頸刮片細胞學(xué)檢查、宮頸和宮頸管活組織檢查以及腫瘤標(biāo)志物檢測等來完成[1]。SOX2是與腫瘤干細胞相關(guān)的重要干性基因，其維持干細胞的自我更新及多潛能性，與干細胞的自我更新、分化有關(guān)，可能是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及耐藥的重要參與因子[2]。本文旨在分析SOX2在宮頸癌組織中的表達情況及其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年1月至2015年6月手術(shù)治療且符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的58例宮頸癌患者的組織標(biāo)本作為研究對象(宮頸癌組)，同時選取同一患者正常的宮頸組織作為對照組?；颊吣挲g38～75歲，平均(49.52±10.74)歲；病理類型：鱗癌46例、腺癌12例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ期51例、Ⅱ期7例；分化程度：高分化35例、中分化18例、低分化5例。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均為在我院婦產(chǎn)科完成手術(shù)治療并進行術(shù)后病理檢查確診,且未行術(shù)前放、化療及免疫治療的宮頸癌患者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位的惡性腫瘤疾病及手術(shù)記錄不全或病理標(biāo)本未確診的宮頸癌患者。

1.3 實驗儀器及試劑 選用上海弗魯克流體機械制造公司生產(chǎn)的電動組織勻漿機；選用蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)的超凈工作臺；選用美國Beckmna公司生產(chǎn)的臺式低溫高速離心機；選用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的PCR儀；選用日本OLYMPUS公司生產(chǎn)的光學(xué)顯微鏡及倒置顯微鏡；選用美國Santa Cruz公司生產(chǎn)的SOX2羊抗人多克隆抗體；選用武漢博士德公司生產(chǎn)的兔抗羊SP試劑盒；選用武漢博士德公司生產(chǎn)的抗羊SABC試劑盒；選用北京中山生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色劑。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)法 (1)組織片預(yù)處理：脫蠟前，將組織芯片在62℃烤箱內(nèi)烘烤30 min或過夜。(2)脫蠟：二甲苯Ⅰ：10 min，二甲苯Ⅱ：10 min，(3)再水化：無水乙醇Ⅰ：10 min，無水乙醇Ⅱ：10 min，95%乙醇：5 min，80%乙醇：5 min。(4)三蒸水浸泡清洗，除去酒精，5 min×2次。(5)提前配置pH 6.0的檸檬酸鈉修復(fù)液，在高壓鍋中加熱至沸騰。將組織芯片插在耐高溫塑料切片架上，放置在高壓鍋里，蓋上鍋蓋及壓力閥，待壓力上升開始噴氣后，計時2 min后，將壓力鍋移開熱源，自然冷卻至室溫。(6)冷卻后取出芯片，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×2次。(7)3%的H2O2封閉10 min(用甲醇配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)。(8)PBS沖洗5 min×2次后，正常兔血清封閉20 min，濾紙吸干；勿洗。(9)用PBS稀釋抗體(SOX2，1:200)，濕盒加適量一抗，4℃過夜。(10)室溫平衡30 min，PBS沖洗5 min×3次。(11)濕盒內(nèi)滴加生物素標(biāo)記二抗(即SABC試劑盒中B液)，室溫放置20 min。(12)PBS沖洗5 min×3次后，濕盒內(nèi)滴加C液，室溫放置20 min，PBS沖洗5 min×3次。(13)DAB顯色(取1 mL蒸餾水，滴加DAB試劑盒中A，B，C試劑盒1滴，混勻后使用)室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，反應(yīng)成功后自來水下沖洗。(14)蘇木素復(fù)染核4 min后，鹽酸乙醇分化20 s，自來水下沖洗干凈。(15)PBS反藍3 min。(16)梯度酒精(脫水)，步驟為75%酒精，5 min；80%酒精，5 min；95%酒精，5 min；100%酒精，5 min；100%酒精，5 min；二甲苯(透明)，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min。(17)中心樹膠封片后，顯微鏡下圖像采集。陰性對照：以未免疫的山羊血清代替一抗，染色與上述免疫組化步驟同步進行，觀察和對照切片的染色結(jié)果。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 參照NCBI上GenBank中發(fā)表的人SOX2基因序列，用Primer5軟件設(shè)計PCR引物,由金斯瑞生物科技公司合成(GAPDH作為內(nèi)源性參照)。Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR擴增，電泳，根據(jù)PCR擴增曲線判讀結(jié)果。

1.5 免疫組化的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) SOX2染色陽性細胞為細胞核呈棕黃色著色細胞，否則為陰性。陽性表達率計算：3個獨立觀察者分別選取5個高倍鏡下獨立視野，計算出陽性細胞數(shù)及所有細胞數(shù)，陽性表達率(%)=(SOX2表達陽性的腫瘤細胞數(shù)/所有腫瘤細胞數(shù))×100%，按陽性表達率定義SOX2表達分級：0:＜10%，1+：10%～25%，2+：26%～50%，3+：51%～75%，4+：＞76%，表達分級為(1+)～(4+)的均為陽性表達，表達分級為0的病例為陰性表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，不同組間陽性率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組標(biāo)本的SOX2蛋白表達水平比較 SOX2蛋白在正常宮頸組織中不表達，在宮頸癌組織中高表達，見圖1。宮頸癌組標(biāo)本SOX2蛋白表達陽性率為62.07%，明顯高于對照組的6.90%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 宮頸癌組與對照組標(biāo)本SOX2蛋白表達(×40)

表1 兩組標(biāo)本中SOX2蛋白表達比較[例(%)]

2.2 兩組標(biāo)本中SOX2 mRNA表達水平比較 宮頸癌組標(biāo)本中SOX2 mRNA表達水平為(14.28±3.41)，明顯高于對照組的(1.32±0.61)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 SOX2蛋白表達與宮頸癌患者臨床特征關(guān)系 SOX2蛋白表達在不同年齡(≥60歲與＜60歲)、不同病理類型(鱗癌、腺癌)、不同F(xiàn)IGO臨床分期中表達陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；SOX2蛋白表達陽性率在高分化與低、中分化的宮頸癌標(biāo)本之間表達陽性率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 SOX2蛋白表達與宮頸癌臨床特征關(guān)系[例(%)]

3 討論

SOX2位于3號染色體長臂2區(qū)6帶3亞帶(3q26.3)，是SOX家族中具有代表性的一個因子，其最早發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎內(nèi)細胞群干細胞內(nèi)，在發(fā)育過程中的許多階段和神經(jīng)組織中均有表達[3]，并被發(fā)現(xiàn)具有許多發(fā)育調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子作用[4-5]。隨后的研究顯示SOX2可發(fā)育成胚胎外胚層的滋養(yǎng)層干細胞。由此可見，在胚胎的發(fā)育過程中，SOX2只表達在全能或多能干細胞中，并在胚胎干細胞的自我更新及未分化狀態(tài)的維持中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。SOX2表達具有干細胞特性，一旦細胞出現(xiàn)分化傾向，其表達水平將逐步降低，直至消失[6]，SOX2的失活也會導(dǎo)致植入后胚胎的死亡[7]，這補充了在胚胎形成過程中SOX2是必須的關(guān)鍵因子的爭論。SOX2基因可與含POU域的OCT3/4蛋白相互作用，直接激活胚胎干細胞相關(guān)基因，并可與OCT3/4蛋白及RAX啟動子上游的一個保守非編碼DNA形成復(fù)合體，最終激活細胞轉(zhuǎn)錄功能[8]。此外，SOX2功能主要與神經(jīng)發(fā)生、形成軟骨以及決定性別等有關(guān)，其對哺乳動物正常發(fā)育，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)的正常發(fā)育存在重要影響。SOX2的缺失可導(dǎo)致哺乳動物出現(xiàn)發(fā)育異?；蛳嚓P(guān)先天性疾病，如無眼、小眼、食管閉鎖、身材矮小、神經(jīng)性聽力喪失等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

SOX2與人類的惡性腫瘤有關(guān)，在腫瘤組織中高表達，如小細胞肺癌和基底細胞乳腺癌[9-10]。SOX2在未分化的胚胎癌細胞高表達，但是在胚胎癌細胞分化以后卻檢測不出SOX2 mRNA的表達[5，11]，這就提示SOX2與胚胎癌細胞未分化狀態(tài)的保持相關(guān)。有研究表明，SOX2在乳腺癌組織呈高表達狀態(tài)，且體外細胞培養(yǎng)實驗證實SOX2在促進乳腺癌細胞增殖，加速腫瘤發(fā)展中具有顯著作用[12]。動物實驗表明，SOX2基因通過加速細胞增殖分化參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。實驗室檢測顯示降低SOX2在小鼠體內(nèi)的表達水平后，小鼠基底細胞比例將隨之下降[14]。細胞培養(yǎng)實驗顯示，SOX2高表達可刺激細胞遷移及黏附獨立生長，但若敲除SOX2基因，細胞增殖能力將大幅降低。還有研究表明，高表達SOX2的非致瘤性人肺支氣管上皮細胞對免疫缺陷大鼠具有致瘤作用，這些均表明SOX2是與干細胞相關(guān)的重要調(diào)節(jié)基因，同時也是癌基因的一種[15]，促進了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)宮頸癌組標(biāo)本的SOX2蛋白陽性率62.07%顯著高于對照組的6.90%，宮頸癌組標(biāo)本中SOX2 mRNA表達水平為(14.28±3.41)，明顯高于對照組(1.32±0.61)，表明SOX2可能是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的重要因子。我們還發(fā)現(xiàn)SOX2蛋白表達水平與宮頸癌患者年齡、病理類型、FIGO臨床分期均無明顯相關(guān)性，提示SOX2蛋白雖可用于宮頸癌的診斷，但在病理分型、臨床分期上無診斷意義。筆者研究也發(fā)現(xiàn)SOX2蛋白表達陽性率在高分化與低、中分化的宮頸癌標(biāo)本之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與SOX2對維持癌細胞的未分化狀態(tài)有關(guān)，當(dāng)癌細胞分化以后，其表達水平逐步降低直至消失。SOX2蛋白在低、中分化宮頸癌標(biāo)本中的表達率高，表明其多能性細胞比例越高，其自我更新、增殖能力更強，臨床惡性度更高。

綜上所述，腫瘤干細胞相關(guān)基因SOX2在宮頸癌組織中的表達明顯高于正常宮頸組織，其表達水平與宮頸癌患者年齡、病理類型、FIGO臨床分期無關(guān)，但與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)。關(guān)于SOX2在宮頸癌發(fā)生中的具體機制，其能否作為臨床治療的一個新靶點，還有待進一步研究。

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Expression of SOX2 in cervical cancer and clinical significance.

ZHAO Zong-xia1,CHEN Qing2,WANG Zhi-rong3, XIANG Meng4,LI Fen-xia1,LIANG Wan-qi1,JIA Qiu-ping1,ZHANG Mei1.1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Hospitial Affiliated to Xi'an Medical University,Xi'an 710038,Shaanxi,CHINA;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Hospital Affiliated to Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710005,Shaanxi,CHINA;3.Department of Gynecology,the Hospital of Northwestern Polytechnical University,Xi'an 710072,Shaanxi,CHINA;4.Teaching and Researching Office of Obstetrics and Gynecology,Department of Clinical Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an 710021, Shaanxi,CHINA

Objective To study the expression of cancer stem cell related gene SOX2 in cervical carcinoma and its clinical significance.MethodsThe cervical tissue specimens of 58 cases of women with cervical cancer,who admitted to Department of Obstetrics and Gynecology of the Second Hospital Affiliated to Xi'an Medical University from January 2012 to June 2015,were selected as the objects of study(cervical cancer).At the same time,the normal cervical tissue of the same patients were chosen as the control group.The difference of SOX2 expression in two groups was detected.ResultsSOX2 protein positive rate of the cervical cancer tissue specimens was significantly higher thanthat of the control group,62.07%(36/58)vs 6.90%(4/58),P＜0.05.The expression of SOX2 mRNA in the cervical cancer tissue specimens(14.28±3.41)was significantly higher than that of in the normal cervical tissue(1.32±0.61),P＜0.01.The SOX2 protein positive rate of in high differentiated cervical cancer tissue specimens was significantly lower than that in the medium and low differentiated cervical cancer tissue specimens,34.29%(12/35)vs 82.61%(19/23),P＜0.05.The expression of SOX2 protein has no statistically difference at different age(≥60 years and＜60 years),different pathological types(squamous cell carcinoma and adenocarcinoma),and FIGO different clinical stage(P＞0.05).ConclusionThe expression of SOX2 in cervical cancer tissue specimens is significantly higher than normal cervical tissue,and negatively related to the differentiation of the tumor.

SOX2;Cervical cancer;Tumor differentiation;Clinical significance

R-332

A

1003—6350（2016）18—2939—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.006

2016-04-13)

陜西省教育廳自然科學(xué)基金(編號：2013JK0797)

張美。E-mail：zhangmei509@163.com